[發明專利]截短型人刺鼠信號蛋白與穿膜肽的融合蛋白及其制備方法與編碼基因有效
| 申請號： | 201711260455.7 | 申請日： | 2017-12-04 |
| 公開（公告）號： | CN107955075B | 公開（公告）日： | 2021-06-04 |
| 發明（設計）人： | 侯增淼;李曉穎;李敏;高恩;楊小琳;趙金禮 | 申請（專利權）人： | 陜西慧康生物科技有限責任公司 |
| 主分類號： | C07K19/00 | 分類號： | C07K19/00;C12N15/81;C12N15/62;C12N15/63;A61K38/17;A61P17/00;A61K8/64;A61Q19/02 |
| 代理公司： | 北京市浩天知識產權代理事務所(普通合伙) 11276 | 代理人： | 劉云貴;周華寧 |
| 地址： | 710054 陜西省西安市雁*** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 截短型人刺鼠 信號 蛋白 穿膜肽 融合 及其 制備 方法 編碼 基因 | ||
1.一種截短型人刺鼠信號蛋白與穿膜肽的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是序列表中SEQ ID No:3的氨基酸序列。
2.權利要求1所述的融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括：
(1)制備質粒：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:4的核苷酸序列，對pPIC9K載體及SEQ ID No:4的核苷酸序列進行XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，回收酶切產物，用DNA連接酶連接，并轉化大腸桿菌，提取質粒；
(2)轉化：將步驟(1)制備的質粒轉化畢赤酵母感受態細胞，獲得轉化后菌落；
(3)多拷貝插入重組子的篩選：將步驟(2)轉化后的菌落進行進一步篩選，獲得轉化子；
(4)發酵：對步驟(3)獲得的轉化子進行發酵培養獲得發酵液；
(5)純化：將步驟(4)得到的發酵液依次進行固液分離、過濾、濃縮和離子交換層析得到產品。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)的純化的具體步驟為：將步驟(4)得到的發酵液經離心進行固液分離，取上清液，對發酵上清液進行微濾，收集濾液，再進行超濾脫鹽濃縮，收集濃縮液，然后進行離子交換層析，即可得到產品。
4.根據權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，包括：
(1)制備質粒
人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:4的核苷酸序列，然后對pPIC9K載體及人工全基因合成的SEQ ID No:4的核苷酸序列進行XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，回收酶切產物，用DNA連接酶連接，并轉化大腸桿菌，提取質粒，命名為pPIC9K-YARA-ASIP50；
(2)畢赤酵母電轉化
將經SalⅠ內切酶線性化的pPIC9K-YARA-ASIP50質粒，與畢赤酵母感受態細胞混勻，轉至冰預冷的電轉化杯中，電擊4～10毫秒，加入冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，涂布MD培養基平板，倒置培養3～4天，在MD培養基平板上長出菌落；
(3)多拷貝插入重組子的篩選
將MD培養基平板上長出的菌落對應接種到G418濃度分別為1g/L、2g/L、3g/L、4g/L的YPD平板上，30℃培養，篩選獲得轉化子；
(4)發酵
將篩選到的轉化子接種于BMGY培養基中，振蕩培養24小時，作為一級種子轉接于裝有FBS培養基的發酵罐中，pH值為5.0培養16～20小時，作為二級種子轉接入裝有FBS培養基的大罐發酵，生長溫度30℃，誘導溫度低于生長溫度，pH值為5.5，溶氧控制在30％，誘導發酵36～42小時；
(5)純化
將步驟(4)得到的發酵液經離心進行固液分離，取上清液，用孔徑為0.22μm中空纖維微濾系統對發酵上清液進行微濾，收集濾液，用截留分子量為1000D的中空纖維超濾系統進行超濾脫鹽濃縮，收集濃縮液，采用SP Sepharose FF進行離子交換層析，即可得到產品。
5.權利要求1所述的融合蛋白的編碼基因。
6.根據權利要求5所述的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因是序列表中SEQ ID No:5的核苷酸序列。
7.含有權利要求5或6所述的編碼基因的表達載體。
8.含有權利要求5或6所述的編碼基因的細胞系。
9.權利要求1所述的融合蛋白在制備藥品中的應用。
10.權利要求1所述的融合蛋白在制備化妝品中的應用。
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