本發(fā)明公開了一種ACAT1基因干擾的嵌合抗原受體T細胞的構(gòu)建和應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種抑制ACAT1基因表達的干擾RNA，以及包含所述干擾RNA和嵌合抗原受體編碼序列的核酸構(gòu)建物，并基于所述shRNA和核酸構(gòu)建物制備了增強型的CAR?T細胞。本發(fā)明的干擾RNA可以有效抑制ACAT1基因的表達，顯著增強CAR?T細胞對腫瘤細胞的殺傷效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種ACAT1基因干擾的嵌合抗原 受體T細胞。

背景技術(shù)

膽固醇是存在于哺乳動物細胞膜中的必需脂質(zhì)分子,大多數(shù)器官和組織的 細胞通過內(nèi)源性膽固醇生物合成滿足了對膜膽固醇的需求。然而，異常高的膽 固醇水平，特別是游離(未酯化)膽固醇，對細胞有害。細胞可以通過抑制內(nèi) 源性膽固醇生物合成和LDL受體表達，以應(yīng)對膽固醇負荷。此外，這些細胞也 已經(jīng)發(fā)展出其他機制來預(yù)防。通過膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)，將游離膽固醇 轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，以防止細胞膜上的游離膽固醇過度積累。編碼膽固醇酯化酶 的兩個關(guān)鍵基因是Acat1和Acat2。Acat1廣泛表達與各種細胞內(nèi)，而Acat2主要 表達于肝臟和小腸。

大量的研究表明膜脂可以直接調(diào)節(jié)T細胞信號傳導(dǎo)和免疫功能。膽固醇作 為細胞膜的關(guān)鍵組成部分，已被證明是形成T細胞受體(TCR)聚合和形成T細 胞免疫突觸所必需的。

嵌合抗原受體T細胞(CART)免疫療法是通過整合嵌合抗原受體的經(jīng)過基 因修飾的T細胞來抵抗腫瘤細胞的療法。嵌合抗原受體可以特異性識別腫瘤相 關(guān)抗原或者腫瘤特異性抗原，識別結(jié)合后將激活及增殖信號傳遞至T細胞內(nèi)， 引起T細胞激活，增殖，釋放細胞因子，從而殺傷腫瘤細胞。CART的殺傷效率 決定了其在體內(nèi)的抗腫瘤效果，因此，如何提高CART的腫瘤殺傷效率具有關(guān)鍵 意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種ACAT1基因干擾的嵌合抗原受體T細胞。具體 地，本發(fā)明通過RNAi的方式干擾膽固醇酯化酶ACAT1基因，從而顯著提升了CART 的腫瘤殺傷效率。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)如下 式A或式B所示：

B1-Z-B2 (A)

B2-Z-B1 (B)

式中，

各“-”獨立地為鍵或核苷酸連接序列；

B1為第一表達盒，所述的第一表達盒用于表達抑制ACAT1基因表達的干擾RNA；

B2為第二表達盒，所述的第二表達盒用于表達嵌合抗原受體；

Z為任選的間隔序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的第二表達盒含有編碼所述的嵌合抗原受體(CAR)的核 酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述干擾RNA針對的靶序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的干擾RNA選自下組：shRNA，miRNA、piRNA、和siRNA。

在另一優(yōu)選例中，所述的干擾RNA為shRNA。

在另一優(yōu)選例中，所述的shRNA的序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的干擾RNA的序列如SEQ ID NO.:14所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一表達盒還包含第一啟動子序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一啟動子包括U6啟動子。

在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸連接序列的長度為m個核苷酸，其中m為1-20(較佳地1-10)的正整數(shù)。