本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)反式?4?羥基?L?脯氨酸的方法。具體地，本發(fā)明提供了一種多肽在生產(chǎn)反式?4?羥基?L?脯氨酸或以反式?4?羥基?L?脯氨酸為前體的下游產(chǎn)物中的用途。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)反式?4?羥基?L?脯氨酸的方法，所述方法包括培養(yǎng)表達所述多肽的菌株，從而得到反式?4?羥基?L?脯氨酸。本發(fā)明還提供了一種反式?4?羥基?L?脯氨酸生產(chǎn)菌株，以及所述反式?4?羥基?L?脯氨酸生產(chǎn)菌株的構建方法。利用本發(fā)明的方法可高效、低成本地產(chǎn)生反式?4?羥基?L?脯氨酸。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域。具體地說，本發(fā)明涉及一種多肽在生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸或以反式-4-羥基-L-脯氨酸為前體的下游產(chǎn)物生產(chǎn)中的用途，以及一種生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法。

背景技術

反式-4-羥基-L-脯氨酸(簡稱羥脯氨酸)，是一種具有獨特生理活性的氨基酸,易溶于水，廣泛應用于醫(yī)藥、化工、動物飼料和美容業(yè)等領域，市場前景廣闊，由于價格昂貴羥脯氨酸目前主要用于合成碳青霉烯類抗生素(美羅培南等)的側(cè)鏈。碳青霉烯類是第三代抗生素，是抗菌譜最廣的一類非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強的特點，全球總體市場已超過了30億美元。

反式-4-羥基-L-脯氨酸可以通過脯氨酸4-羥化酶催化L-脯氨酸羥基化來生產(chǎn)，目前用于生產(chǎn)L-脯氨酸等氨基酸的工程菌主要是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、大腸桿菌(E.coli)等，但是這些菌都沒有編碼脯氨酸4-羥化酶的基因。因此，挖掘能夠在L-脯氨酸生產(chǎn)菌中表達并具有高效催化活性的脯氨酸4-羥化酶是實現(xiàn)反式-4-羥基-L-脯氨酸工業(yè)生產(chǎn)的關鍵。

脯氨酸4-羥化酶的催化反應

日本協(xié)和發(fā)酵公司通過篩選得到一株脯氨酸4-羥化酶酶活最高的指孢囊菌，并命名為指孢囊菌RH1，測序獲得脯氨酸4-羥化酶基因序列(CN96190335)；該脯氨酸4-羥化酶在大腸桿菌中異源表達主要形成包涵體，進行密碼子優(yōu)化后置于一個強啟動子的調(diào)控下，導入到大腸桿菌中，添加外源L-脯氨酸，在發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化100小時后，反式-4-羥基-L-脯氨酸的積累量達到41g/L，轉(zhuǎn)化效率只有87％(Shibasaki,Takeshi,Hideo Mori,and AkioOzaki.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-andstereospecific hydroxylation of L-proline.Bioscience,biotechnology,andbiochemistry 64.4(2000):746-750)。為了進一步降低反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)成本，日本協(xié)和發(fā)酵公司又將密碼子改造的指孢囊菌RH1脯氨酸4-羥化酶基因?qū)氲絃-脯氨酸生產(chǎn)菌中，在以葡萄糖為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)99小時后反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量達到25g/L，發(fā)酵溫度為33℃，發(fā)酵過程中L-脯氨酸最高積累量達到7.8g/L，初步實現(xiàn)了羥脯氨酸的從頭合成(CN97117929.8和Shibasaki,Takeshi,et al.Construction of anovel hydroxyproline-producing recombinant Escherichia coli by introducing aproline 4-hydroxylase gene.Journal of bioscience and bioengineering 90.5(2000):522-525.)，該文獻水平為目前報道的最高水平。