本發明涉及五指毛桃的RPA快速鑒定方法及鑒定用RPA引物，具體涉及一種食藥同源五指毛桃的鑒定方法；此外本發明還涉及鑒定五指毛桃的特異性RPA引物。本發明旨在鑒別藥食同源的廣東道地藥材五指毛桃真偽，通過設計特異性的RPA引物，優化RPA反應條件，并結合樣品DNA快速提取方法，以達到快速、準確的鑒定五指毛桃藥材真偽的目的。

技術領域

本發明涉及植物類食品或藥材真偽鑒定技術領域，具體涉及一種食藥同源五指毛桃的鑒定方法。

背景技術

中藥鑒定是中藥研究工作的基礎和前提，直接關系到中藥各項研究工作的結論和臨床療效。其任務是鑒定中藥的真、偽、優、劣，整理中藥復雜品種，尋找和擴大新藥源。傳統的中藥鑒定方法主要包括基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定四大類，各種方法均有其特點和適用對象，有時候還需要幾種方法配合才能完成對一種中藥材的準確鑒定。目前傳統的鑒定方法，存在在不同程度的局限性，如主觀性強、穩定性和重復性差等。近年，DNA分子標記技術的興起，為中藥的快速和準確鑒定帶來了新的契機。隨著RFLP，RAPD，DNA條形碼(DNA barcoding)等分子標記技術研究的不斷深入，中藥的質量評價也迎來了一次新的技術革命。雖然這些技術的發展為物種的快速鑒定提供了分子水平的精細分類學標準，使藥材的準確、快速鑒定成為可能，但是DNA分子標記技術都涉及到PCR過程：(1)必須依賴熱循環儀(如PCR儀)對解鏈、退火、延伸等過程進行溫度控制(2)實驗操作步驟復雜，擴增時間較長，通常擴增時間需要至少2-3小時，甚至1-2天；(3)對待測物種DNA模板質量要求高。因此，探索出一種準確、快速、可靠的鑒別中藥材的方法就非常有必要。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術是近10年發展起來的一種新型的在恒溫下可以使核酸快速擴增的方法。該技術在37℃-39℃恒溫下，利用重組酶可與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的復合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白(single stranded DNA binding,SSB)的幫助下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈。反應產物呈指數級增長，通常在，15min內即完成擴增，整個反應過程無需特殊的輔助儀器(如核酸擴增儀)，對操作人員的要求也不高，具備簡單、節能、快速等特點，因為不需要高溫循環，所以特別適合中藥材大量樣品的快速檢測。目前，RPA技術已廣泛應用于各種病毒、細菌、轉基因物種等方面的檢測，因此該發明技術在中藥材快速鑒別的實踐具有廣闊的應用前景，本發明即采用RPA技術進行五指毛桃快速鑒別。若把該技術引入到法醫鑒定、臨床診斷、海關違禁生物檢測、企業質檢等領域，同樣也具有明顯的實用價值。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種五指毛桃的RPA快速鑒定方法。

本發明一個方面提供一種五指毛桃鑒定的RPA特異性引物組合物，其序列為

上游引物RPA-ITS-F:5'-TCAAGGAAAGACAACGAGACGATCCCAGCC-3'SEQ ID No.1

下游引物RPA-ITS-R:5'-CGACTACCTGTTGCCAAGACGACGTGACAG-3'SEQ ID No.2。

本發明另一個方面提供了提供五指毛桃鑒定方法，其包括如下步驟：

將待測樣品以權利要求1所述的RPA特異性引物組合物進行重組酶聚合酶擴增，檢測擴增產物。

在本發明的技術方案中，待測樣品的制備方法為粉碎樣品后加入提取緩沖液混勻；煮沸后取出，加入0.1mol/L Tris–HCl，離心后取上清得到待測樣品。

在本發明的技術方案中，擴增反應的溫度為27℃-52℃，優選為37℃-42℃。

在本發明的技術方案中，擴增反應的時間為15分鐘以上。