技術領域：

本發明屬于一種血小板臨床試驗研究時用來檢測免疫性血小板減少癥血小板自身抗體的具有較高特異性和敏感性的新型試驗檢測方法。

背景技術：

血小板減少癥是臨床上血液科常見疾病。根據發病機制的不同可分為免疫性血小板減少癥和非免疫性血小板減少癥。如何區分兩者需要一種較高特異性和敏感性的血小板自身抗體試驗檢測方法。

目前血小板抗體的檢測方法出現的早晚，可分為I期、II期及III期檢查方法。I期檢查出現于19世紀50年代至70年代，主要檢測患者血清或血漿在體外對正常血小板功能的影響，所用的試驗方法均是間接法，其敏感性和特異性均很低。II期試驗方法在19世紀70年代發展起來，主要是檢測血小板相關抗體。血小板相關抗體雖然有較高的敏感性但特異性較低。III期試驗方法是在19世紀80年代中期發展起來的抗原特異性分析法。最近發展起來的糖蛋白俘獲檢查法-即單克隆抗體固定特異血小板抗原法，不僅可檢測血小板特異性抗體(間接法)而且可檢測血小板相關的特異性抗體(直接法)；并且血小板裂解發生在特異性抗體與血小板膜糖蛋白結合后，避免了去垢劑處理對自身抗原表位的破壞；試驗中在分離的試管內洗滌致敏的正常血小板，阻止了血漿/血清與塑料的粘附，減低了背景干擾。血小板裂解發生在特異性抗體以及抗GP單克隆抗體與抗原結合之后，同時保護了特異性抗體及單克隆抗體的結合表位。但現已發現人血清中存在能與鼠抗體反應的嗜異性抗體，而上述方法同時孵育正常血小板、待測血清及鼠源性抗體，可能受到人抗鼠抗體的干擾，產生假陽性結果。因此傳統的單克隆抗體固定特異血小板抗原法仍需適當的改進來提高試驗結果的特異性和敏感性。

發明內容：

本發明的主要任務是為血小板臨床試驗研究提供一種具有較高特異性和敏感性的檢測免疫性血小板減少癥血小板特異性抗體的的新型試驗檢測方法。

本發明的技術方案包括以下步驟：

1制備備抗體包被多孔板，每孔內加入羊抗鼠單克隆抗體(一抗)，過夜孵育后，加入抗血小板單克隆抗體，室溫孵育備用；

2離心分離患者血清或血小板表面的血小板特異性抗體，加入正常人O型血小板，室溫孵育，血小板溶解液溶解血小板，制成上清液；

3將上述上清液加入步驟1制備好的抗體包被多孔板，室溫孵育，再加入堿性磷酸酶標 記的羊抗人單克隆抗體(二抗)，室溫孵育；

4加PNPP/底物緩沖劑溶液，室溫孵育至顯色，觀察結果；

5所有試驗數據用配對T檢驗進行統計學分析。

本發明先將O型正常人血小板與患者待測血清或血小板洗脫液反應，洗滌后裂解血小板，離心取上清稀釋后待用。在抗鼠抗體包被的多孔板中，先加入抗血小板膜糖蛋白單克隆抗體(鼠抗人單克隆抗體)再加入稀釋上清液，然后加入酶標二抗和底物，從而避免人抗鼠抗體與鼠單克隆抗體直接結合引起的干擾。

附圖說明：

附圖1是本發明的原理示意圖。

具體實施方式：

本發明的檢測步驟如下：

1.血小板表面抗體洗脫

(1)抽取抗凝血10ml(每10ml全血中加入1ml 5％的EDTA)。

(2)200轉每分，10分鐘，離心2次。

(3)取上清(富含血小板的血漿，PRP)，加入EP管離心(1000g，15分鐘)取沉淀。

(4)沉淀用PBS/EDTA(1-1.5ml)洗兩遍(1000g，15分鐘)。

(5)棄上清，加入800ul改良Tyrode溶液。

(6)加入180ul 0.1MHCl，PH 2.8-2.9。

(7)20℃搖動水浴中10分鐘。

(8)常溫下離心，3900轉/分，12分鐘。

(9)取900ul上清，即刻加入80ul 0.2MNaOH中和。

(10)常溫下離心，3900轉/分，12分鐘。

(11)取上清，標記，置-70℃保存。

2.多孔板抗體包被

(1)準備包被液10ml，抗體終濃度3ug/ml[17ul羊抗鼠單克隆抗體(1.8mg/ml)+10ml碳酸緩沖液]。

(2)加樣，100ul/孔。

(3)塑料薄膜覆蓋，4℃過夜。

(4)0.01M PRS/Tween洗滌兩次(260ul/孔，甩干)。

(5)每孔加入封閉液(0.01M PBS/Tween/3％BSA)200ul，置室溫下30分 鐘。

(6)去除封閉液，控干。

(7)即用，否則應置-70℃，塑料薄膜覆蓋。

3.單抗俘獲