本發明提供了一種制備低血清培養的懸浮293T細胞系的方法，該方法包括：(1)復蘇并培養哺乳動物細胞，得到貼壁培養的該293T細胞，用胰酶消化；(2)用添加了一定量血清的無血清培養基培養該貼壁培養的293T細胞，連續培養該293T細胞至適應該添加了一定量血清的無血清培養基；以及(3)重復步驟(2)中的該連續培育程序，逐漸降低該無血清培養基中的血清添加量至血清濃度為0，得到該懸浮培養的293T細胞。本發明操作簡單，方便使用，費用低，安全性好。293T細胞懸浮培養的體外擴增培養方法無需特殊設備，操作簡單可行。293T細胞懸浮培養的基礎研究及臨床應用上將具有廣泛的前景。

技術領域

本發明涉及醫藥生物領域，具體涉及一種懸浮培養細胞的方法。

背景技術

體外細胞的培養方法包括貼壁培養和懸浮培養，貼壁培養(是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養；懸浮培養通過振蕩或轉動裝置使細胞始終處于分散懸浮于培養液內的培養方法；其中懸浮培養又可分為微載體懸浮培養及全懸浮培養。與貼壁培養相比，懸浮培養具有如下優點：(1)可連續擴大生產量；(2)有利于細胞培養基中的營養物質和氣體充分接觸，而且易于控制培養條件(溫度、pH、氧分壓和CO2等)；(3)培養條件穩定，趨于均一，便于進行定量研究；(4)易于在連續密閉的系統中進行，減少了操作步驟和污染的機會；(5)可以長期連續培養，既可節省人力，又使細胞能持續維持在對數生長期；(6)懸浮培養的細胞仍保持原先對病毒的敏感性和生物學特性。

293細胞是用5型腺病毒75株系轉化，含有Ad5E1區的人胚腎亞三倍體細胞系，是一種E1區缺陷互補細胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉染技術構建而成。293細胞是貼壁依賴型呈上皮樣細胞，表現出典型的腺病毒轉化細胞的表型，細胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293細胞屬于貼壁細胞系，在無Ca2+或含Ca2+培養基中可同樣生長，也可生長在血清濃度降低的培養基中，現有技術中，實驗證實細胞傳代次數過多對293細胞單層培養方式下細胞的生長產生了明顯的影響。293T細胞由293細胞派生，同時表達SV40大T抗原，含有SV40復制起始點與啟動子區的質粒可以復制。用Ca3(PO4)2轉染效率可高達50％。蛋白表達水平高，轉染后2-3天用堿性磷酸酶分析可較容易地檢測到表達的蛋白。瞬時轉染293T細胞是過表達蛋白并獲得細胞內及細胞外(分泌的或膜)蛋白的便捷方式。

現階段工業化單層培養293T細胞時，培養基中均加一定比例的牛血清(包括胎牛血清或新生牛血清)細胞才能正常生長，牛血清不僅價格貴，而且牛血清來源于自然生物體，牛源本身攜帶和采集加工過程有污染外源微生物和致病因子的可能，使用會存在生物安全風險。另外，牛血清是一種天然混合物，其具體成份目前還沒有完全分析清楚，生物制品生產中使用后對下游純化工藝造成困難，如果有殘留通常會引起接種者的副反應而影響產品質量。生物制品生產中細胞培養如能采用無血清全懸浮工藝，培養規模就容易線性放大，避免了細胞貼壁培養和使用牛血清帶來的工藝缺陷，可提高病毒產量和產品質量，但是馴化無血清全懸浮培養型細胞株是目前最關鍵的技術瓶頸之一。

發明內容

針對以上原因，本發明提供了一種貼壁細胞進行懸浮培養的方法，本方法通過逐級降低胎牛血清的濃度，充分利用了懸浮培養的優點，使得貼壁細胞可以進行簡化、高效、大量的培養。

本發明提供了一種制備無血清培養的懸浮哺乳動物細胞的方法，該方法包括：(1)復蘇并培養哺乳動物細胞，得到貼壁培養的哺乳動物細胞，用胰酶消化；(2)用添加了一定量血清的無血清培養基培養該貼壁培養的哺乳動物細胞，連續培養該哺乳動物細胞至適應該添加了一定量血清的無血清培養基；以及(3)重復步驟(2)中的該連續培育程序，逐漸降低該無血清培養基中的血清添加量，直至最后血清含量為0，最后把懸浮細胞放到搖床上搖動培養。

優選地，所述步驟(1)中的哺乳動物為293T細胞。

優選地，所述步驟(2)和(3)中的所述無血清培養基包括Free style。