1.全懸浮培養(yǎng)型293T細胞系的馴化方法，其特征在于：步驟如下：

(1)貼壁培養(yǎng)型293T細胞的培養(yǎng)

選用經無菌、支原體、外源病毒檢定為陰性，貼壁培養(yǎng)型293T細胞，待細胞生長致密單層后用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液按1：3比例分瓶傳代，置37℃5％CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在48-72h內細胞形成致密單層，為邊緣清晰的扁平上皮型細胞且細胞生長正常的情況下可用于馴化；

(2)低血清貼壁培養(yǎng)型293T細胞系的馴化

a)將步驟(1)所述生長正常的貼壁培養(yǎng)型293T細胞分別用含胎牛血清10％的DMEM培養(yǎng)液各培養(yǎng)三代；每次傳代的標準是按1：4比例分瓶，在37℃5％CO2培養(yǎng)，在48-72h內細胞形成致密單層；

b)將培養(yǎng)液換成Free style培養(yǎng)基后加10％胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)三代，傳代標準同步驟a)；

c)培養(yǎng)液中胎牛血清降為5％，按b步驟中的方法，傳代比例降為1：3再培養(yǎng)三代；

d)培養(yǎng)液中胎牛牛血清降為2％，在培養(yǎng)液中再加體積百分含量20％上一代次培養(yǎng)了該細胞48-72h的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)三代；

傳代標準同步驟c)；細胞在48h-72h內形成致密單層，馴化得到了低血清貼壁培養(yǎng)型293T細胞系；

(3)低血清全懸浮培養(yǎng)型293T細胞的馴化

a)將步驟(2)馴化的低血清貼壁培養(yǎng)型293T細胞，用Free style無血清培養(yǎng)基按體積比1：1比例混合后，加2％胎牛血清制成培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液將細胞密度調整至2-5×10⁵/ml，125r/min、37℃5％CO2搖床培養(yǎng)；

b)重復步驟a)，每培養(yǎng)三代降低血清濃度，胎牛血清濃度依次從2％到1％到0.5％；

b)每培養(yǎng)48h取樣計數，細胞密度未達到1×10⁶/ml時，800-1000r/min離心后換用新鮮培養(yǎng)液重新懸浮培養(yǎng)；細胞密度達到1×10⁶/ml時，800-1000r/min離心按1：2比例分瓶培養(yǎng)；至細胞密度達到2×10⁶/ml時，800-1000r/min離心按1：3比例分瓶培養(yǎng)；在連續(xù)三代按1：3比例培養(yǎng)48h細胞密度均達2×10⁶/ml時，馴化得到低血清全懸浮培養(yǎng)型293T細胞系；

(4)無血清全懸浮培養(yǎng)型293T細胞的馴化

a)在無血清培養(yǎng)基中加0.2％胎牛血清，將步驟(3)中得到的低血清全懸浮培養(yǎng)型293T細胞直接稀釋到密度5×10⁵/ml，置125r/min、37℃5％CO2搖床培養(yǎng)；

b)每培養(yǎng)24h取樣計數，細胞密度達到3×10⁶/ml時，將細胞懸液直接稀釋至5×10⁵/ml接種培養(yǎng)，血清降為0，完全用無血清培養(yǎng)培養(yǎng)，在連續(xù)三代培養(yǎng)48h細胞密度均達3×106/ml時，馴化得到無血清全懸浮培養(yǎng)型293T細胞系。