技術領域

本發明涉及細胞工程技術領域，具體涉及一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法。

背景技術

MLL-AF9融合基因在嬰兒與髓系和淋巴系侵襲性白血病都有相關性，而在成體，這種易位主要與急性髓系白血病相關。這些結果暗示在胚胎和成體組織白血病發展的細胞來源方面存在差異。我們猜測細胞來源的內在特性在決定白血病的譜系方面扮演了重要角色。

事實上，新生兒CD34⁺細胞表達MLL-AF9可永生化為髓系或淋巴系細胞，而成體骨髓CD34⁺細胞的永生化更難以實現，且具有強烈的髓系偏好性。

發明內容

本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法。

本發明技術方案的設計思路為：

為獲得具有永生化能力的小鼠血液髓系細胞，申請人在來源于成年骨髓的血液祖細胞/干細胞中表達MLL-AF9融合基因。這種策略產生了克隆化的并依賴于細胞因子的髓系細胞系。由于正常的髓系細胞本身并不表達MLL-AF9，在血液細胞中異位表達MLL-AF9可能會改變這些細胞，改變原代髓系細胞的某些生物學特性。為克服這一缺陷，申請人擬采用Tet-On誘導型逆轉錄病毒載體，通過添加Doxycycline來誘導MLL-AF9基因在成年骨髓的血液祖細胞/干細胞中表達，獲得髓系細胞系；而在這些永生化的髓系細胞用于生物學功能實驗前，撤銷Doxycycline，終止MLL-AF9基因的表達。

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法，是采用Tet-On誘導型逆轉錄病毒載體，通過添加Doxycycline以誘導MLL-AF9融合基因在成年骨髓的血液祖細胞/干細胞中表達，獲得髓系細胞系。

進一步的，上述的一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法，所述MLL-AF9融合基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ No.1所示。

進一步的，上述的一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法，包括以下步驟：

1）用BamHI/XhoI雙酶切從TtRMPVIR質粒上切下dsRed基因片段，并將帶BamHI/XhoI黏性末端的MLL-AF9 cDNA連接入逆轉錄病毒載體TtRMPVIR質粒，成功構建的質粒命名為VIR-MLL-AF9；

dsRed基因的表達受四環素調節元件TREtight嚴格調控，載體組成型表達反式作用因子rtTA3，在Doxycycline的作用下發生構象變化，激活四環素調節元件TREtight，啟動下游基因的表達；撤銷Doxycycline，則下游基因的表達終止；

2）將VIR-MLL-AF9質粒轉染逆轉錄病毒包裝細胞系GP+E-86，獲得條件性表達MLL-AF9融合基因的逆轉錄病毒；所述細胞系GP+E-86包含莫羅尼氏鼠白血病病毒Mo-MuLV的gag，pol和env區域；

3）將10-12周齡的C57BL/6小鼠在獲取骨髓3天前用5-氟尿嘧啶按150mg/kg處理，獲取骨髓后在IMDM培養基中培養48小時，培養基中添加10%胎牛血清，0.15mM的MTG，100 ng/mL 的SCF，10ng/mL的IL-6和10ng/mL的IL-3；

4）用含有4μg/mL Polybrene的逆轉錄病毒上清液轉導步驟3）所述骨髓細胞，室溫，轉速2000rpm離心90分鐘，將細胞轉移至培養箱孵育6小時后，棄去含Polybrene的的逆轉錄病毒上清液，更換為步驟3）所述的添加有各種成分的IMDM培養基，培養48小時，用流式細胞儀分析Venus+的Lineage-Sca-1+c-kit+細胞，Lineage包含CD3ε，B220，TER-119，CD11b，和Gr-1；分選出的細胞培養于步驟3）所述的添加有各種成分的IMDM培養基，并添加1μg/mL的Doxycycline；最后存活的細胞即為永生化的小鼠髓系細胞。

本發明的有益效果為：本發明提供的一種永生化小鼠髓系細胞系的制備方法，通過條件性表達MLL-AF9獲得的永生化的髓系細胞系（圖2右側）和成年小鼠骨髓中的原代髓系細胞（圖2左側）相比，具有相似的表面標志物，即CD11b⁺，但永生化的髓系細胞系極易擴增，獲得大量均一的細胞群體。

附圖說明

圖1顯示為逆轉錄病毒載體TtRMPVIR質粒的圖譜。

圖2顯示為永生化的髓系細胞系在髓系細胞生長因子作用下的分化情況。

圖3 顯示為永生化的髓系細胞系在Giemsa染色后鏡下觀察細胞核的特點。