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[發(fā)明專(zhuān)利]一種永生化小鼠髓系細(xì)胞系的制備方法在審

專(zhuān)利信息
申請(qǐng)?zhí)枺?/td> 201710562949.4 申請(qǐng)日: 2017-07-11
公開(kāi)(公告)號(hào): CN107201381A 公開(kāi)(公告)日: 2017-09-26
發(fā)明(設(shè)計(jì))人: 曹欣;蔡葵蒸;馬曉霞;薛宇佳;許強(qiáng);王波波 申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人: 西北民族大學(xué)
主分類(lèi)號(hào): C12N15/867 分類(lèi)號(hào): C12N15/867;C12N5/10
代理公司: 北京挺立專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙)11265 代理人: 倪鉅芳
地址: 730000 甘*** 國(guó)省代碼: 甘肅;62
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摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 一種 永生 小鼠 細(xì)胞系 制備 方法
【權(quán)利要求書(shū)】:

1.一種永生化小鼠髓系細(xì)胞系的制備方法,其特征在于,是采用Tet-On誘導(dǎo)型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,通過(guò)添加Doxycycline以誘導(dǎo)MLL-AF9融合基因在成年骨髓的血液祖細(xì)胞/干細(xì)胞中表達(dá),獲得髓系細(xì)胞系。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化小鼠髓系細(xì)胞系的制備方法,其特征在于,所述MLL-AF9融合基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ No.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種永生化小鼠髓系細(xì)胞系的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)用BamHI/XhoI雙酶切從TtRMPVIR質(zhì)粒上切下dsRed基因片段,并將帶BamHI/XhoI黏性末端的MLL-AF9 cDNA連接入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體TtRMPVIR質(zhì)粒,成功構(gòu)建的質(zhì)粒命名為VIR-MLL-AF9;

dsRed基因的表達(dá)受四環(huán)素調(diào)節(jié)元件TREtight嚴(yán)格調(diào)控,載體組成型表達(dá)反式作用因子rtTA3,在Doxycycline的作用下發(fā)生構(gòu)象變化,激活四環(huán)素調(diào)節(jié)元件TREtight,啟動(dòng)下游基因的表達(dá);撤銷(xiāo)Doxycycline,則下游基因的表達(dá)終止;

2)將VIR-MLL-AF9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系GP+E-86,獲得條件性表達(dá)MLL-AF9融合基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒;所述細(xì)胞系GP+E-86包含莫羅尼氏鼠白血病病毒Mo-MuLV的gag,pol和env區(qū)域;

3)將10-12周齡的C57BL/6小鼠在獲取骨髓3天前用5-氟尿嘧啶按150mg/kg處理,獲取骨髓后在IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí),培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清,0.15mM的MTG,100 ng/mL 的SCF,10ng/mL的IL-6和10ng/mL的IL-3;

4)用含有4μg/mL Polybrene的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟3)所述骨髓細(xì)胞,室溫,轉(zhuǎn)速2000rpm離心90分鐘,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱孵育6小時(shí)后,棄去含Polybrene的的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液,更換為步驟3)所述的添加有各種成分的IMDM培養(yǎng)基,培養(yǎng)48小時(shí),用流式細(xì)胞儀分析Venus+的Lineage-Sca-1+c-kit+細(xì)胞,Lineage包含CD3ε,B220,TER-119,CD11b,和Gr-1;分選出的細(xì)胞培養(yǎng)于步驟3)所述的添加有各種成分的IMDM培養(yǎng)基,并添加1μg/mL的Doxycycline;最后存活的細(xì)胞即為永生化的小鼠髓系細(xì)胞。

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