本發明提供一種基因VII型新城疫病毒弱毒株的構建方法，是將VII型新城疫病毒的P蛋白的237位和240位的氨基酸分別突變為蘇氨酸和異亮氨酸。本發明的方法構建的基因VII型新城疫病毒弱毒株制備的疫苗均能誘導產生較高的中和抗體，能抵抗強毒力基因VII型新城疫病毒的侵害，有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于疫苗病毒株構建技術領域，具體涉及一種基因VII型新城疫病毒弱毒株的構建方法。

技術背景

新城疫是由新城疫病毒引起的一種急性烈性傳染病，對養禽業的危害極大，曾經被國際獸疫局(OIE)列為A類病。ND于1926年首先被發現于印度尼西亞爪哇，同年發現于英國的紐卡斯爾城，此后迅速向世界各地傳播。目前ND已在世界范圍內發生了四次大流行，并且宿主范圍不斷擴大。

劉秀梵等對1985‐2003年分離自江蘇浙江地區的29株新城疫病毒進行序列分析，結果顯示有17株屬于基因VII型，其中10株分離自發病鵝群。劉華雷等對2005年分離自中國大陸地區的83株新城疫病毒進行分析顯示，其中64株屬于基因VII型。Lien等對2003‐2006年間分離自臺灣地區的20株新城疫病毒均為基因VII型。此外同階段中國周邊的韓國和日本流行的NDV也大都為基因VII型。我們對本實驗室近年分離的部分NDV毒株也進行了測序分析，結果顯示，70％以上的毒株為基因VII型。由此看出，基因VII型新城疫病毒在中國禽群中廣泛流行，是目前的絕對優勢基因型。

當前市場上對新城疫病毒的防控主要使用IV系疫苗株Lasota、clone30和II系疫苗株B1等基因II型的毒株，它們雖然可以提供一定的免疫保護，但是不能完全阻止新城疫病毒的傳播、擴散，特別是基因VII型新城疫病毒的流行給養殖業造成了巨大的經濟損失。由于流行的基因VII型新城疫病毒都是強毒，因此大多數毒株不適合作為疫苗株使用，除非是自然弱毒株或是基因工程手段人工致弱的毒株。獲得弱毒株是生產疫苗的關鍵。

發明內容

本發明的目的是提供一種基因VII型新城疫病毒弱毒株的構建方法，從而能夠構建獲得低毒力的基因VII型新城疫病毒弱毒株

本發明提供的構建VII型新城疫病毒弱毒株的方法，是將VII型新城疫病毒的P蛋白的237位和240位的氨基酸分別突變為蘇氨酸(T)和異亮氨酸(I)。

上述的獲得VII型新城疫病毒弱毒株的方法，其一種具體操作方法是通過反向遺傳操作方法來構建VII型新城疫病毒弱毒株，其包括如下的步驟：

構建表達T7RNA聚合酶的細胞系、

所述的細胞系，是將表達T7RNA聚合酶的基因與載體PCI‐neo連接后轉染DF1細胞獲得的；

提供基因VII型新城疫病毒NDV拯救過程中需要的三個輔助重組質粒和一個全基因組重組載體，三個輔助重組質粒分別包含NDV的NP蛋白、P蛋白和L蛋白基因；其中P蛋白的237位和240位的氨基酸分別為T和I；

將三個輔助重組質粒和一個全基因組重組載體轉入到表達T7RNA聚合酶的細胞系中，培養獲得基因VII型新城疫病毒弱毒株。

更進一步的，所述的構建方法，是在將基因VII型新城疫病毒的P蛋白的237位和240位的氨基酸分別突變為T和I時，將F蛋白也進行弱毒性突變。

本發明的方法構建的基因VII型新城疫病毒弱毒株制備的疫苗均能誘導產生較高的中和抗體，能抵抗強毒力基因VII型新城疫病毒的侵害，有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1：新城疫F基因片段PCR鑒定圖；

圖2：NDV毒株(WF株、SL株)基于F基因片段的系統發生樹；

圖3：新城疫9個基因片段PCR鑒定結果圖；