本發明提供了一種提高頭孢菌素C酰化酶活性的方法及其應用，所述方法包括制備卡那霉素抗性基因和ptsG基因雙缺陷型的大腸桿菌菌株；將攜帶頭孢菌素C酰化酶基因的表達載體轉化所述大腸桿菌菌株，獲得轉化子；培養并誘導所述轉化子表達頭孢菌素C酰化酶。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種提高頭孢菌素C酰化酶活性的方法及其應用。

背景技術

7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)是工業發酵生產抗生素過程中的重要中間體，利用它可以轉化合成目前使用的多種常見的頭孢類藥物。7-ACA的生產有兩類：化學法和酶轉化法。化學法的合成過程復雜，對環境有污染，目前相關研究更多的是酶轉化法。酶轉化法又分兩步酶法和一步酶法。兩步酶法相對一步酶法易于實現，但多了一個步驟，產物回收處理等增加了生產成本，故而相對高效的一步酶法更受研究人員青睞，然而，一步酶法中使用的頭孢菌素C酰化酶(CPCAcy)，酶活一直難以提高，從而限制了其在工業生產中的應用。

頭孢菌素C酰化酶是能將頭孢菌素C(CPC)轉化為7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)的水解酶，適宜的反應pH為8.0左右。在菌體發酵培養過程中，使用磷酸鹽緩沖液可以將發酵液穩定在pH8.0左右，CPCAcy活性有明顯提升。培養基優化時發現，在LB培養基的基礎上添加甘油和葡萄糖，均有助于出發菌株CPCAcy酶活的提高，且添加甘油對CPCAcy酶活的影響更加明顯。大腸桿菌利用葡萄糖進行代謝，產生酸性產物乙酸，酸性的環境會對CPCAcy酶活有影響。P1噬菌體可將供體菌DNA轉移到受體菌，使受體菌的基因型與表現型發生改變，這個過程稱為轉導。P1噬菌體在復制時，頭部包裝易發生錯誤，可將供體菌基因組的部分DNA片段誤包入頭部蛋白質衣殼中。這些供體菌的DNA片段隨P1噬菌體進入受體菌，替換受體菌中部分染色體組DNA并可永久保留在受體菌基因組中。P1噬菌體轉導的頻率一般很低，需要使用選擇性標記進行轉導子篩選，本發明使用的選擇性標記為卡那霉素抗性基因(KnR)。本發明通過P1噬菌體轉導獲得敲除了ptsG基因的BL21(DE3)菌株，再使用帶有氨芐青霉素抗性的溫度敏感型pCP20質粒將標記基因(KnR)敲除，得到無抗性、無ptsG基因的BL21(DE3)菌株。并將表達載體pET-28a-CPCAcy、pACYCDuet-1-CPCAcy、pETDuet-1-CPCAcy和pRSFDuet-1-CPCAcy通過化學轉化法，轉入到無抗性、無ptsG基因的BL21(DE3)菌株的菌株中。結果表明敲除ptsG基因的菌株，對頭孢菌素C酰化酶活性具有有益的影響。

發明內容

本發明的一個目的是提供了一種提高頭孢菌素C酰化酶活性的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)制備卡那霉素抗性基因和ptsG基因雙缺陷型的大腸桿菌菌株；

(2)將攜帶頭孢菌素C酰化酶基因的表達載體轉化所述大腸桿菌菌株，獲得轉化子；

(3)培養并誘導所述轉化子表達頭孢菌素C酰化酶。

進一步地，上述方法中所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

進一步地，上述方法中所述的表達載體為pET-28a-CPCAcy、pACYCDuet-1-CPCAcy、pETDuet-1-CPCAcy和pRSFDuet-1-CPCAcy，它們的結構圖分別如圖1-4所示。其中，本發明優選pACYCDuet-1-CPCAcy表達載體。

本發明的另一個目的是提供一種培養本發明所述轉化子的培養基，所述培養基包括以下配方：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，0.3％甘油，PH為8.0。

本發明的又一個目的是提供本發明所述方法在提高頭孢菌素C酰化酶活性中的應用。