本發(fā)明公開了一種利用同工酶共催化合成2,3?丁二醇的方法，通過兩個以上具有互補(bǔ)性催化優(yōu)勢的2,3?丁二醇脫氫蛋白(又稱2,3?丁二醇脫氫酶)的共同催化，能夠?qū)?,3?丁二醇的前體高效并且徹底地轉(zhuǎn)化為2,3?丁二醇。本發(fā)明通過同工酶共催化合成2,3?丁二醇的方法，不僅能夠提高2,3?丁二醇合成的效率，還能夠?qū)崿F(xiàn)其前體物質(zhì)完全轉(zhuǎn)化，因而能夠顯著提高細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)中2,3?丁二醇合成支路的通量以及2,3?丁二醇合成過程的經(jīng)濟(jì)性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和生物催化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

2,3-丁二醇可以作為一種潛在的平臺化合物，替代傳統(tǒng)的平臺化合物——碳四烴，用于大規(guī)模的合成甲乙酮(優(yōu)良溶劑)和1,3-丁二烯(廣泛應(yīng)用于合成橡膠、聚酯和聚亞胺酯等領(lǐng)域)。生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法可分為化學(xué)法和生物法。由于2,3-丁二醇結(jié)構(gòu)特殊，化學(xué)法生產(chǎn)2,3-丁二醇主要是以石油裂解時產(chǎn)生的四碳類碳?xì)浠衔镌诟邷馗邏合滤獾玫剑杀靖摺⑦^程煩瑣、不易操作，所以一直很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

生物法即通過微生物發(fā)酵或者酶催化的方法生產(chǎn)2,3-丁二醇。隨著傳統(tǒng)化學(xué)法所帶來的環(huán)境問題日益嚴(yán)重，各國政府對環(huán)境問題越來越關(guān)注的前提下，將可再生的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為化工原料的研究得到廣泛的關(guān)注；相比于對環(huán)境破壞較為嚴(yán)重的化學(xué)方法生產(chǎn)2,3-丁二醇，生物法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、生產(chǎn)成本較低，化學(xué)法的生產(chǎn)成本則很高；2、對環(huán)境友好，并不會像化學(xué)方法給環(huán)境保護(hù)帶來很大壓力，2,3-丁二醇作為有機(jī)合成中間體取代了許多的化合物和其它石化產(chǎn)品的市場，前景廣闊，社會、環(huán)境效益顯著，非常有利于該產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用；3、可再生性，擺脫了化學(xué)法對化石原料的依賴性，因此具有很好的應(yīng)用前景。目前2,3-丁二醇的商業(yè)價格達(dá)100000元/噸。

然而，生物法與化學(xué)法相比，亦存在很多不足之處，其中最為重要的就是生物催化劑合成2,3-丁二醇的濃度低、速率低，前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化不徹底，導(dǎo)致了產(chǎn)品后分離純化困難、碳原料收率低下等問題，其根本原因是生物催化過程中催化2,3-丁二醇合成的蛋白的催化性能不夠穩(wěn)定。生物體內(nèi)能夠催化2,3-丁二醇合成的蛋白種類眾多、催化性能各異，然而目前生物法合成2,3-丁二醇的研究中，無論是采用生物發(fā)酵還是酶催化的方式，其2,3-丁二醇合成過程均主要由單個2,3-丁二醇脫氫蛋白催化完成。比如CN201480068734.1中提到的乙偶姻向2,3-丁二醇轉(zhuǎn)化即是導(dǎo)入單個2,3-丁二醇脫氫蛋白編碼基因，從而增加2,3-丁二醇的產(chǎn)量；ChiamYu Ng等研究酵母產(chǎn)2,3-丁二醇的途徑時，也只是對單個基因進(jìn)行操作(Nget al.,Microbial Cell Factories 2012 11:68)；Soojin Lee等研究合成左型2,3-丁二醇是在大腸桿菌中對budA(乙酰乳酸脫羧反應(yīng)蛋白編碼基因)和meso-budC(編碼內(nèi)消旋型2,3-丁二醇合成基因)操作合成純的內(nèi)消旋型2,3-丁二醇(Soojin Lee,Borim Kim etal.,Synthesis of Pure meso-2,3-Butanediol from Crude Glycerol Using anEngineered Metabolic Pathway in Escherichia coli 2012 1801-1813)。Li等人在大腸桿菌中進(jìn)行全細(xì)胞催化合成2,3-丁二醇也僅僅對單個2,3-丁二醇脫氫酶基因進(jìn)行表達(dá)(Lixiang Li et al.,Biocatalytic production of(2S,3S)-2,3-butanediol fromdiacetyl using whole cells of engineered Escherichia coli 2012 111-116)。單獨(dú)采用一種蛋白進(jìn)行2,3-丁二醇的合成往往導(dǎo)致催化合成效率低、前體物質(zhì)利用不完全等問題的出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的問題是，提供一種同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供技術(shù)方案如下：