技術領域

本發明涉及一種檢測凈化磺胺類藥物殘留的免疫親和柱的制備，屬于免疫學和食品檢測檢疫技術領域。

背景技術

動物源性食品中的磺胺類藥物殘留是廣泛關注的一類獸藥，這些殘留進入人體后會引起人體的過敏反應，并可能具有一定的致癌性。因此，對磺胺類藥物殘留的研究成為檢食品檢測工作者的焦點。檢測過程中基質的干擾比較大，目前檢測的凈化方法主要有固相萃取、液液萃取等，操作較為繁瑣，凈化動物源性樣品前處理復雜；選擇性比較低，且凈化效果不理想，雜質干擾很大；回收率和重復性比較差。

發明內容

為解決現有技術存在的技術問題，本發明提供了一種特異性高、凈化效果好、操作簡便的免疫親和柱（Immunoaffinity column，IAC），并研究開發適合于肉蛋奶等多種動物源性食品基質，能夠降低液質聯用儀檢測時存在的基質效應，可同時檢測多種磺胺類藥物殘留的靈敏、快速、簡便的分析方法。

本發明技術方案如下：一種免疫親和柱的制備方法，所述的免疫親和柱為檢測凈化磺胺類藥物殘留的免疫親和柱，所述的免疫親和柱是由三種免疫親和柱按照體積1:1:1混合裝柱，制得的復合親和柱，所述的三種免疫親和柱是由三種單克隆抗體巴曲霉毒素單克隆抗體5H4、 NR3C2單克隆抗體2B5和PPBP單克隆抗體5C7分別與珠狀瓊脂糖基質溴化氰活化Sepharose 4B偶聯，濕法裝柱制得的三種免疫親和柱，具體制備過程如下：

第一步：兩種磺胺類藥物的人工抗原TS-BSA和SM2-BSA的制備，由四甲基硫代二碳二酰胺TS和SM2磺胺二甲嘧啶抗原與牛血清白蛋白BSA和卵清蛋白偶聯而得；

第二步：第一步所得的抗原為免疫原對小鼠免疫后得到B淋巴細胞，B淋巴細胞與骨髓瘤細胞細胞融合得雜交瘤細胞，采用體內誘生腹水法制備得到上述3種單克隆抗體,

第三步：三種免疫親和柱，由第二步的種單克隆抗體與珠狀瓊脂糖基質溴化氰活化Sepharose 4B偶聯，濕法裝柱，得到的三種免疫親和柱。

所述的第一步：兩種磺胺類藥物的人工抗原TS-BSA和SM2-BSA、的制備，具體制備步驟如下：

（1）SM2半抗原的合成： SM2 溶于無水硫酸鈉處理過的吡啶，丁二酸酐溶于無水吡啶與SM2液混勻溶解,攪拌反應24 h，反應液移入置有水的1分液漏斗中搖勻，靜置，用CH2Cl2進行萃取輕搖，注意放氣萃取3 次，收集下層CH2Cl2相，，合并3次萃取CH2Cl2相，用0.1mol/L HCl洗提3次后，用H2O 再洗一次收集下層CH2Cl2相，在萃取液中加入一定量的無水Na2SO4脫水，在蒸發皿中加入甲苯低溫蒸干，將濾液真空干燥重結晶用乙酸乙酯洗滌糊狀物得到白色晶體SM2-SA，

（2）SM2-BSA偶聯蛋白質的制備：取步驟（1）制得的10 mg SM2-SA溶解在0.5 mL的無水DMF中,再加入6 mg NHS和10 mg DCC室溫攪拌過夜，以4000r/min離心5min離心除去沉淀后將上清液，慢慢地邊攪拌邊滴加于20 mg溶于2 mL的碳酸鹽緩沖液的BSA和溶液中，攪拌反應4 h，反應結束以后取上清液裝入透析袋，用pH 7.4的磷酸緩沖液PBS緩沖液透析2 天，每天更換3次透析液，得M2-BSA偶聯蛋白質。

（3）半抗原TS的合成

TS合成步驟：稱取2-氨基-4-噻唑乙酸7.8 g加入到100 mL無水甲醇中，加入20mL三甲基氯硅烷，0℃回流2 d。旋轉蒸發去除有機溶劑，用250mL乙酸乙酯提取，用50 mL飽和NaHCO₃水溶液洗四次（至pH>7），30 mL飽和NaCl水溶液洗2次，MgSO₄干燥，過濾，旋轉蒸發,用30 mL乙酸乙酯和5 mL甲醇重結晶，得到（2 -氨基-4 -噻唑基）-乙酸甲酯。用5 mL吡啶溶解，加入3.6 g N-乙酰磺胺酰氯，室溫攪拌24 h，反應完，加入2 mL乙醇，用4M HCl調節pH至3，10-20分鐘后產生沉淀，過濾后真空干燥，得到產物，將產物溶解到25 mL 2M氫氧化鈉溶液中，室溫回流5h，用4M的鹽酸調節PH 4，用25mL乙酸乙酯萃取4次，用硫酸鎂干燥，旋轉蒸干得到TS；

（4）TS-BSA的合成