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[發明專利]一種免疫親和柱的制備方法在審

專利信息
申請號: 201710118407.8 申請日: 2017-03-01
公開(公告)號: CN106908597A 公開(公告)日: 2017-06-30
發明(設計)人: 花錦 申請(專利權)人: 花錦
主分類號: G01N33/536 分類號: G01N33/536;G01N30/02;G01N30/06
代理公司: 暫無信息 代理人: 暫無信息
地址: 030024 山*** 國省代碼: 山西;14
權利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關鍵詞: 一種 免疫 親和 制備 方法
【權利要求書】:

1.一種免疫親和柱的制備方法,其特征在于,所述的免疫親和柱為檢測凈化磺胺類藥物殘留的免疫親和柱,所述的免疫親和柱是由三種免疫親和柱按照體積1:1:1混合裝柱,制得的復合親和柱,所述的三種免疫親和柱是由三種單克隆抗體巴曲霉毒素單克隆抗體5H4、 NR3C2單克隆抗體2B5和PPBP單克隆抗體5C7分別與珠狀瓊脂糖基質溴化氰活化Sepharose 4B偶聯,濕法裝柱制得的三種免疫親和柱,具體制備過程如下:第一步:兩種磺胺類藥物的人工抗原TS-BSA和SM2-BSA的制備,由四甲基硫代二碳二酰胺TS和SM2磺胺二甲嘧啶抗原與牛血清白蛋白BSA和卵清蛋白偶聯而得;第二步:第一步所得的抗原為免疫原對小鼠免疫后得到B淋巴細胞,B淋巴細胞與骨髓瘤細胞細胞融合得雜交瘤細胞,采用體內誘生腹水法制備得到上述3種單克隆抗體,第三步:三種免疫親和柱,由第二步的種單克隆抗體與珠狀瓊脂糖基質溴化氰活化Sepharose 4B偶聯,濕法裝柱,得到的三種免疫親和柱。

2.根據權利要求1所述的免疫親和柱的制備方法,其特征在于,所述的第一步:兩種磺胺類藥物的人工抗原TS-BSA和SM2-BSA、的制備,具體制備步驟如下:(1)SM2半抗原的合成: SM2 溶于無水硫酸鈉處理過的吡啶,丁二酸酐溶于無水吡啶與SM2液混勻溶解,攪拌反應24 h,反應液移入置有水的1分液漏斗中搖勻,靜置,用CH2Cl2進行萃取輕搖,注意放氣萃取3 次,收集下層CH2Cl2相,合并3次萃取CH2Cl2相,用0.1mol/L HCl洗提3次后,用H2O 再洗一次收集下層CH2Cl2相,在萃取液中加入一定量的無水Na2SO4脫水,在蒸發皿中加入甲苯低溫蒸干,將濾液真空干燥重結晶用乙酸乙酯洗滌糊狀物得到白色晶體SM2-SA,(2)SM2-BSA偶聯蛋白質的制備:取步驟(1)制得的10 mg SM2-SA溶解在0.5 mL的無水DMF中,再加入6 mg NHS和10 mg DCC室溫攪拌過夜,以4000r/min離心5min離心除去沉淀后將上清液,慢慢地邊攪拌邊滴加于20 mg溶于2 mL的碳酸鹽緩沖液的BSA和溶液中,攪拌反應4 h,反應結束以后取上清液裝入透析袋,用pH 7.4的磷酸緩沖液PBS緩沖液透析2 天,每天更換3次透析液,得M2-BSA偶聯蛋白質;(3)半抗原TS的合成,TS合成步驟:稱取2-氨基-4-噻唑乙酸7.8 g加入到100 mL無水甲醇中,加入20mL三甲基氯硅烷,0℃回流2 d,旋轉蒸發去除有機溶劑,用250mL乙酸乙酯提取,用50 mL飽和NaHCO3水溶液洗四次(至pH>7),30 mL飽和NaCl水溶液洗2次,MgSO4干燥,過濾,旋轉蒸發,用30 mL乙酸乙酯和5 mL甲醇重結晶,得到(2 -氨基-4 -噻唑基)-乙酸甲酯,用5 mL吡啶溶解,加入3.6 g N-乙酰磺胺酰氯,室溫攪拌24 h,反應完,加入2 mL乙醇,用4M HCl調節pH至3,10-20分鐘后產生沉淀,過濾后真空干燥,得到產物,將產物溶解到25 mL 2M氫氧化鈉溶液中,室溫回流5h,用4M的鹽酸調節PH 4,用25mL乙酸乙酯萃取4次,用硫酸鎂干燥,旋轉蒸干得到TS;(4)TS-BSA的合成,4.1稱取TS 62 mg,NHS 34 mg,DCC 44 mg,溶解到1.5 mL DMF中,室溫攪拌24 h;分別稱取BSA 20mg溶解到3 mL pH 7.0 PBS中,分別將上述步驟中制得的0.5 mL DMF溶液,緩慢滴加到蛋白溶液中,室溫攪拌24 h,用pH 7.0 磷酸緩沖液PBS溶液透析3 h,通過紫外掃描,計算出TS-BSA偶聯比分別為10:1;SM2-BSA偶聯比分別為15:1。

3.根據權利要求1所述的免疫親和柱的制備方法,所述的第二步,制備得到上述3種單克隆抗體, 分別為三種單克隆抗體巴曲霉毒素單克隆抗體5H4、 NR3C2單克隆抗體2B5和PPBP單克隆抗體5C7,其中巴曲霉毒素單克隆抗體5H4是由SM2-BSA免疫原免疫小鼠得到的細胞株,NR3C2單克隆抗體2B5和PPBP單克隆抗體5C7是由ST-BSA免疫原免疫小鼠得到的細胞株。

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