本發明公開了一種含有萊茵衣藻褪黑素合酶AANAT基因的植物雙元表達載體。其將萊茵衣藻褪黑素合酶AANAT基因、博萊霉素抗性基因Ble和植物雙元表達載體pRI101?AN重組得到表達載體pRI101?AANAT。本發明以萊茵衣藻為受體，以農桿菌介導法為方法，可以實現外源AANAT基因轉入野生型具有細胞壁的萊茵衣藻的基因組，從而增加萊茵衣藻中的褪黑素含量，為研究轉基因藻株中褪黑素含量變化及探索褪黑素在萊茵衣藻中的功能奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種用于轉化萊茵衣藻的 AANAT基因植物雙元表達載體的構建。

背景技術

褪黑素(meLatonin，MT；N-乙酰基-5-甲氧基-色胺)是色氨酸的吲哚衍生物，分子式為C13H16N2O2，相對分子量為232.27，熔點116-118℃，純品為淡黃色葉片狀結晶。高親脂性和部分親水性的褪黑素屬中性偏弱酸性，不溶于水，易溶于丙酮、乙醇、乙醚等有機溶劑，受熱易破壞。褪黑素具有吲哚雜環性質，能與羥自由基（–OH）和烷過氧自由基（ROO–）等反應。

1958年，MT最早被Lerner等發現于脊椎動物腦中松果體腺(pineaL gLand)，首次從牛松果體中分離出，L963年正式被確認為激素，也稱松果體腺素，普遍存在于動物、藻類、真菌和細菌中。

褪黑素作為一種動物激素，對脊椎動物生物節律和光周期反應有調控作用，同時褪黑素能與一些自由基發生反應，是一種有效的抗氧化劑；另外，褪黑素與生殖系統，免疫、內分泌系統的密切相關，可以防治老年癡呆、帕金森病、季節性抑郁癥、癲病等癥等。褪黑素在植物體內也有類似的功能：可以調節晝夜節律和光周期、誘導植物的成花過程；擔當植物體內重要的抗氧化劑，在衰老過程中防止紫外線和臭氧的損傷，對抗光氧化并保護葉綠素，增強植物低溫、高鹽脅迫耐受性，抗真菌病害等等；起類似于植物激素吲哚-3-乙酸 IAA 的植物生長素作用，促進根、葉等營養生長；抑制植物細胞凋亡等。

褪黑素的合成和代謝研究目前動物體內比較清楚，以色氨酸為原料合成5-羥色胺儲存于體內，再經過酶促反應生成褪黑素，即色氨酸在松果體細胞中，通過色氨酸羥化酶和5-羥色胺脫羧酶作用生成5-羥色胺，再由關鍵合成酶芳烷基胺N-乙酰轉移酶（AryLaLkayLamine -N- AcetyLtransferase，SNAT/AANAT）作用轉變為前體物N-乙酰色胺，然后進一步經羥基吲哚-O-甲基轉移酶甲基化形成褪黑素。合成后的褪黑素直接以pg水平釋放于血液中，約20min半衰期，在肝臟中通過三種代謝途徑，由腎臟排出。

在植物中的褪黑素生物合成途徑類似于動物。在藻類中，研究發現，褪黑素合成酶AANAT/SNAT在系統進化中具有保守性，褪黑素合成及代謝途徑同樣類似于動物體合成通路，保存了色氨酸合成能力，但SNAT/AANAT的代謝通路尚不明確。

科學界關注的藻類研究體系中，綠藻門綠藻綱團藻目綠藻科衣藻屬的萊茵衣藻(ChLamydomonas reinhardtii)是一種單細胞真核綠藻，素有“綠色酵母”或者“光和酵母”之稱，具有生長快、世代時間短、適應能力強和易培養(即易在平板上形成單克隆，易液體培養)，遺傳背景清晰等優點，體內的細胞核、葉綠體和線粒體3套基因組均能進行相應的遺傳轉化，是藻類基因工程的模式植物，常被用作分子生物學遺傳研究材料，高效表達來自原核和真核生物的基因。