本發明涉及羧肽酶Y的檢測領域，具體涉及用于檢測羧肽酶Y的半菁類熒光探針及其制備方法和應用。公開了半菁類熒光探針及其制備方法，該半菁類熒光探針具有式(1)的結構，其中以特戊基作為羧肽酶Y的識別基團；其合成方法包括：在親核反應條件和縛酸劑存在下，在有機溶劑中，將式(2)化合物與特戊酰氯接觸。本發明還公開了該探針在檢測羧肽酶Y的活性中的應用及檢測羧肽酶Y活性的方法和檢測試劑盒。本發明的半菁類熒光探針用于與羧肽酶Y活性檢測有關的應用時，靈敏度高、選擇性好、熒光強度的變化大易于檢測，穩定性更高、使用更方便、價格更低廉。

技術領域

本發明涉及羧肽酶Y的檢測領域，具體地，涉及一種半菁類熒光探針，該半菁類熒光探針的制備方法和在檢測羧肽酶Y的活性中的應用，以及一種羧肽酶Y活性的檢測方法和羧肽酶Y活性的檢測試劑盒。

背景技術

羧肽酶Y(EC號：3.4.16.1)，可水解所有具有羧基末端的氨基酸，已成為蛋白多肽鏈C末端分析中的常用工具酶。此外羧肽酶Y還可通過轉肽反應使其它氨基酸衍生物或親核物質取代肽鏈末端的氨基酸殘基，從而形成新肽。

目前測定羧肽酶Y活性的主要方法有紫外吸收光譜法和熒光分光光譜法。有紫外吸收光譜法所需要的底物結構簡單，操作方便，目前已經獲得廣泛使用，但是紫外方法存在以下兩方面的缺陷：首先，紫外吸收光譜法的背景干擾大導致分析的靈敏度低；其次，用于分析的底物多為肽類，該類底物合成難度大，成本較高。熒光分光光譜法主要以多肽類熒光探針為底物，反應靈敏度高于紫外分光光譜法，但用于分析的多肽底物合成難度大，成本高，且在常規條件下大都穩定性差，存儲和允許條件苛刻，原子利用率低。此外，以三甲基乙酸對硝基苯酯底物可以不用多肽底物，但是以三甲基乙酸對硝基苯酯底物的檢測是紫外可見方法，靈敏度非常有限。

目前國內外還沒有非肽類近紅外熒光探針用于檢測羧肽酶Y的活性的報道。因此，設計開發基于非肽類近紅外熒光探針來提高檢測羧肽酶Y的靈敏度和選擇性是非常迫切和需要的。

發明內容

本發明的目的在于克服現有羧肽酶Y活性檢測技術中存在的缺陷，本發明提供了一種高選擇性、高靈敏度、性質穩定、操作簡便、易于儲運且成本低廉的非肽底物型羧肽酶Y活性檢測熒光探針及其制備方法和應用。

為達到上述目的，第一方面，本發明提供了一種半菁類熒光探針，該半菁類熒光探針具有式(1)所示的結構；

第二方面，本發明還提供了如上所述的半菁類探針的制備方法，該方法包括：在親核反應條件和縛酸劑存在下，在有機溶劑中，將式(2)所示結構化合物與特戊酰氯中接觸反應；

第三方面，本發明還提供了如上所述的半菁類熒光探針在檢測羧肽酶Y的活性中的應用。

第四方面，本發明還提供了檢測羧肽酶Y活性的方法，其中，該方法包括：

將待測樣品與如上所述的半菁類熒光探針接觸，使得待測樣品中的羧肽酶Y被所述半菁類熒光探針中的特戊基所識別，得到接觸后的物料；

檢測接觸后的物料在激發光下發出的熒光強度隨時間的增加值，所述熒光強度的增加值指示了待測樣品中羧肽酶Y的活性；所述激發光的波長為500-680nm，所述熒光的發射波長為690-740nm。

第五方面，本發明還提供了一種羧肽酶Y活性的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括：如上所述的半菁類熒光探針、羧肽酶Y標準品以及反應緩沖液。

本發明的半菁類熒光探針在用于檢測羧肽酶Y活性時，探針與羧肽酶Y具有更高的親和力和更高的選擇性，檢測靈敏度更高。

本發明提供的半菁類熒光探針熒光探針，在用于檢測羧肽酶Y的活性時，與采用多肽類熒光探針相比，具有更高的靈敏度和選擇性；且合成的方法簡單快速，熒光背景值低。