技術領域

本發明屬于微生物基因工程技術領域，尤其涉及一種根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法。

背景技術

茭白(Zizania latifolia)又稱菰，為禾本科菰屬多年生宿根草本植物，其肉質鮮嫩，富含豐富營養物質和多種藥用成分。廣泛栽培于長江流域及以南地區，廣西柳州、桂林、賀州等地區素有種植。隨著茭白產業不斷發展，種植面積不斷擴大，目前茭白已成為我國第二大水生蔬菜。

茭白黑粉菌(Ustilago esculenta)屬于擔子菌門黑粉菌科，研究發現，茭白黑粉菌為茭白植株的內生真菌，茭白能否孕茭與其成功侵染密切相關。當茭白植株受茭白黑粉菌侵染后，由于茭白抽穗開花受抑制，莖部組織受刺激膨大形成肉質莖，其中呈現白嫩可食用的肉質莖的稱為正常茭白，而布滿褐色孢子的肉質莖的茭白為灰茭，不可食用。據報道，誤食茭白黑粉菌可引起肺炎。灰茭和正常茭白中的茭白黑粉菌在形態上存在較大的差異，茭白黑粉菌在灰茭中主要以冬孢子(T型)形式存在，致使茭肉呈褐色，而茭白黑粉菌在正常茭白中則多以菌絲型(MT型)存在，使茭肉呈白色。因此，深入研究茭白黑粉菌，對揭示茭白孕茭機理與茭白育種工作具有重要意義。

用分子生物學手段研究茭白黑粉菌為揭示茭白孕茭機理和加快茭白育種進程提供新的研究思路。分離和鑒定茭白黑粉菌致病與孕茭機理相關基因是關鍵所在，而建立真菌遺傳轉化技術創造缺陷突變體則是分離和鑒定該相關基因的一種有效途徑。Yu jiajia等建立了PEG介導茭白黑粉菌原生質體的遺傳轉化體系，雖然通過該遺傳轉化體系獲得了敲除突變體及EGFP綠色熒光蛋白過表達，但該轉化體系存在一定缺陷，不僅需要制備繁瑣的敏感原生質體，且還需要對轉化載體進行線性化處理才能獲得轉化子。

目前，絲狀真菌遺傳轉化技術已成為植物病原真菌分子遺傳和基因功能研究的重要手段。由農桿菌介導的真菌遺傳轉化技術(ATMT)已經成功應用于U.maydis、Pseudozyma antarctica、U.hordei、S.scitamineum等黑粉菌及其它絲狀真菌中。已有大量文獻證明，農桿菌介導的真菌轉化與PEG轉化方法相比，具有轉化效率高、轉化子T-DNA為單拷貝、隨機插入頻率高等優點。此外，PEG轉化時的受體只能為原生質體，而高濃度的PEG對原生質體有毒害作用。而由農桿菌轉化獲得的轉化子比較穩定，由ATMT得到的轉化子，在沒有選擇壓力的培養基上培養幾代后也不會喪失抗生素抗性。迄今，未見茭白黑粉菌農桿菌介導的遺傳轉化體系相關報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種操作簡單、轉化效率高、穩定性好的根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法，以茭白黑粉菌孢子為轉化受體材料，將含有雙元載體的根癌農桿菌與茭白黑粉菌孢子混合后共培養，用抗生素篩選，獲得抗性轉化子。

上述根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法，包括以下步驟：

<1>茭白黑粉菌孢子的制備；

<2>含載體農桿菌的準備；

<3>轉化。

步驟<1>按以下操作進行：在YePSA固體培養基上將茭白黑粉菌培養2天后，將茭白黑粉菌接種至YePS液體培養基，搖床200rpm，培養2天，然后5000rpm離心收集菌體，加入ddH₂O₂制成1×10⁷個/mL孢子懸浮液，獲得茭白黑粉菌孢子懸浮液，備用。

步驟<2>按以下操作進行：利用質粒pEX2-eGFP和pEX2-RFP為轉化載體，pEX2-eGFP載體攜帶綠色熒光蛋白基因eGFP和潮霉素抗性篩選基因hph，pEX2-RFP載體攜帶紅色熒光蛋白基因RFP和潮霉素抗性篩選基因hph，通過電擊轉化的方法將質粒pEX2-eGFP和pEX2-RFP載體分別轉入農桿菌感受態細胞中；挑含有雙元載體的根癌農桿菌菌體至5mL的MM液體培養基中，28℃，200rpm，培養過夜，用IM液體培養基將菌液稀釋OD₆₀₀至0.15，28℃下預誘導培養6h，使菌液OD₆₀₀調至為0.5備用。