[發明專利]根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法在審
| 申請號: | 201610791295.8 | 申請日: | 2016-08-31 |
| 公開(公告)號: | CN107299108A | 公開(公告)日: | 2017-10-27 |
| 發明(設計)人: | 顏梅新;江文;歐昆鵬;桂杰;董偉清;高美萍;何芳練;張尚文;王艷 | 申請(專利權)人: | 廣西壯族自治區農業科學院生物技術研究所 |
| 主分類號: | C12N15/80 | 分類號: | C12N15/80;C12R1/645 |
| 代理公司: | 廣西南寧公平知識產權代理有限公司45104 | 代理人: | 楊立華 |
| 地址: | 530007 廣西壯族*** | 國省代碼: | 廣西;45 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 根癌農 桿菌 茭白 黑粉菌 遺傳 轉化 方法 | ||
1.一種根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法,其特征在于:以茭白黑粉菌孢子為轉化受體材料,將含有雙元載體的根癌農桿菌與茭白黑粉菌孢子混合后共培養,用抗生素篩選,獲得抗性轉化子。
2.根據權利要求1所述的根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法,其特征在于包括以下步驟:
<1>茭白黑粉菌孢子的制備;
<2>含載體農桿菌的準備;
<3>轉化。
3.根據權利要求1所述的根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法,其特征在于步驟<1>按以下操作進行:在YePSA固體培養基上將茭白黑粉菌培養2天后,將茭白黑粉菌接種至YePS液體培養基,搖床200rpm,培養2天,然后5000rpm離心收集菌體,加入ddH2O2制成1×107個/mL孢子懸浮液,獲得茭白黑粉菌孢子懸浮液,備用。
4.根據權利要求1所述的根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法,其特征在于步驟<2>按以下操作進行:利用質粒pEX2-eGFP和pEX2-RFP為轉化載體,pEX2-eGFP載體攜帶綠色熒光蛋白基因eGFP和潮霉素抗性篩選基因hph,pEX2-RFP載體攜帶紅色熒光蛋白基因RFP和潮霉素抗性篩選基因hph,通過電擊轉化的方法將質粒pEX2-eGFP和pEX2-RFP載體分別轉入農桿菌感受態細胞中;挑含有雙元載體的根癌農桿菌菌體至5mL的MM液體培養基中,28℃,200rpm,培養過夜,用IM液體培養基將菌液稀釋OD600至0.15,28℃下預誘導培養6h,使菌液OD600調至為0.5備用。
5.根據權利要求1所述的根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法,其特征在于:所述MM液體培養基為基本培養基,其配方為:1.45g KH2PO4,2.05g K2HPO4,0.5gNH4NO3,0.01g CaCl2,0.3g(NH4)SO4,2g Glucose,0.01g FeSO4,5ml Z-buffer,加雙蒸水定容至1000mL,pH6.7-7.0;所述誘導培養基配方為:1g Glucose,7.808gMES,1.45g KH2PO4,0.5g NH4NO3,0.6g MgSO4·7H2O,0.01g CaCl2,0.3g NaCl,0.5g(NH4)SO4,HCl調pH值到5.6,雙蒸水定容至1000mL。
6.根據權利要求1所述的根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法,其特征在于:所述Z-buffer中含有以下成分CuSO4*5H2O,ZnSO4*7H2O,MnSO4*H2O,H3BO3和NaMbO4*2H2O各0.01%。
7.根據權利要求1所述的根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法,其特征在于步驟<3>按以下操作進行:分別取步驟<1>中茭白黑粉菌孢子懸浮液和步驟<2>中農桿菌培養液各100μL,混合后涂板于含AS的覆蓋有纖維素濾膜的IM固體培養基上,24℃下共培養48h-72h;轉移纖維素濾膜至含有潮霉素B和頭孢噻肟鈉的YePSA,28℃下培養5-8d;將長出的單菌落轉化子用牙簽挑到含有潮霉素B和頭孢噻肟鈉的YePSA上進行二次篩選;第二次篩選獲得的抗潮霉素B的茭白黑粉菌即為轉化子。
8.根據權利要求1所述的根癌農桿菌介導的茭白黑粉菌的遺傳轉化方法,其特征在于:所述IM固體培養基由每升誘導培養基加25克瓊脂構成。
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