技術領域

本發明涉及核酸擴增領域，具體涉及核糖核酸(RNA)的反轉錄擴增方法。

背景技術

作為遺傳信息的載體，DNA和RNA是生命科學研究的重要對象。而從生物體內直接獲得的DNA和RNA往往因載量不夠，需要通過體外擴增進行富集。目前，主要的體外擴增DNA的方法包括聚合酶鏈式反應(PCR)，等溫擴增技術(如HDA、SDA、RPA、EXPAR、LAMP、NASBA、RCA等)等。此類技術多以DNA作為直接的擴增模板。

RNA的體外擴增，往往需要先以RNA為模板，通過反轉錄酶合成cDNA，再以cDNA為模板進行擴增。和DNA擴增體系相比，RNA擴增體系有三個不同點：以RNA而非DNA為模板；體系中需添加反轉錄酶；PCR擴增之前，需要額外的反轉錄程序。因此，反轉錄的效率主要受上述3個因素的影響。

(1)RNA模板對反轉錄的影響：a.純度：高質量的RNA是高反轉錄效率的前提，可以增加cDNA合成的長度和產量。一方面，需盡可能去除樣品及提取試劑中有可能會抑制反轉錄酶及聚合酶活性的物質，如裂解液；另一方面，需盡可能維持RNA的完整性，避免RNA斷裂或降解，如在提取時加入RNase抑制劑。b.結構：RNA本身的二級結構會影響引物與之結合的效率，并進而影響反轉錄效率。因此，適當提高反轉錄溫度、或在體系中加入適量的DMSO或甘油等，均對打開RNA的二級結構有輔助作用，從而提高反轉錄效率。

(2)酶對反轉錄的影響：a.反轉錄酶的種類：最常用的反轉錄酶包括鼠白血病逆轉錄酶(MMLV)和禽類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶(AMV)。MMLV的最適反應溫度為37℃，其合成cDNA的長度范圍大致為100-500個核苷酸。AMV的最適反應溫度為42-55℃，最高可達60℃，因此，如果RNA結構比較復雜時，應用可耐受更高溫的AMV進行反轉錄的效果要優于MMLV，此外，其體外合成cDNA的長度范圍也優于MMLV。但是，上述兩種酶除具有以RNA為模板，催化dNTP聚合成cDNA的DNA聚合酶活性外，還具有Rnase H活性；通常來說AMV要比MMLV RNaseH的活性高一些。RNaseH活性會同反轉錄酶的聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，因而會降低cDNA合成的產量和長度，因此，目前所用的大多數商品化的反轉錄酶會通過突變或刪除等方式降低或去除其RNaseH的活性。此外，研究人員還會通過基因工程的改造，提高反轉錄酶的耐熱性和cDNA合成速度，從而提高反轉錄的效率。b.反轉錄酶的用量：在反轉錄時間一定時，反轉錄酶濃度偏低可能導致cDNA合成速率降低，因此，適當提高反轉錄酶濃度可以提高單位時間內cDNA的合成速率，并在一定程度上彌補反轉錄時間不足的缺陷。

(3)程序對反轉錄的影響：根據cDNA合成過程與DNA擴增過程是否在同一緩沖液及酶中進行，以RNA為模板的擴增可分為兩步法和一步法。

兩步法是在反應管內先進行以RNA為模板的cDNA合成，再取出少量該管內的產物作為模板，進行第二步聚合酶鏈式反應。其優點是：反轉錄與擴增在不同的反應管中進行，可分別進行條件優化。缺點是：操作復雜，開管取樣易造成污染；僅有部分合成的cDNA作為模板參與第二輪擴增。

一步法中，cDNA的合成及以cDNA為模板的擴增是在同一反應管中進行的。其優點是：①反轉錄及擴增過程無需更換反應管，操作簡單，還可避免因開管而造成的污染；②反轉錄合成的所有cDNA均可作為PCR擴增的起始模板。一步法在剛出現的時候并不受歡迎，這是因為其體系優化較兩步法要復雜。具體而言，一步法中所有的反應組分均在同一反應管內，該反應管內的緩沖條件、離子強度等，既要滿足反轉錄的需求，還要滿足后續擴增的要求。針對該問題，市場上已有多種商品化的一步法RT-PCR試劑預混液，既能保障反轉錄的效率，又能確保后續的高效擴增，研究人員僅需將適量的模板、引物及水加入預混液中即可完成反應液的配制。因此，一步法RT-PCR，特別是在診斷領域，得到了越來越廣泛的認可及應用。