技術領域

本發(fā)明涉及一種創(chuàng)制蕪菁和蘿卜屬間雜種的方法，屬于生物技術育種技術領域。

背景技術

蘿卜是十字花科植物中蕓薹屬(Brassica)的近緣屬，通過屬間遠緣雜交，已經(jīng)獲得蘿卜和蕓薹屬間的雙二倍體雜種，并被命名為新的物種。由于遠緣雜交的生殖隔離、種間雜種的不親和性、雜種敗育以及雜種不育等共性問題，為了獲得有性雜交的雜種，人們采用了多種技術和方法，包括嫁接、混合授粉、切柱頭、化學藥物處理等，但這些技術和方法對蕓薹屬與蘿卜的遠緣雜交，效果不大。房相佑在研究蘿卜與蕓薹野生種屬間雜交時發(fā)現(xiàn)：蕓薹種與蘿卜雜交時受精前障礙較小，蕓苔種的雌蕊允許蘿卜花粉萌發(fā)和花粉管伸長，但是受精后障礙嚴重；胚培養(yǎng)技術保障了蘿卜和蕓薹屬植物間遠緣雜交的成功。

蕪菁是十字花科蕓薹屬蕓薹種蕪菁亞種，同蘿卜一樣都是以其肥大肉質(zhì)根供食用。進行蘿卜和蕪菁的遠緣雜交，一方面可以創(chuàng)造新型遺傳材料，如：人工合成新物種有助于探明物種間的種屬進化關系；培育異附加系，在促進物種之間的基因漸滲和分子細胞遺傳研究生有著重要的作用，同時在分子細胞遺傳學中，可用來增加遺傳圖譜精確度，用于分子標簽和克隆外源基因、染色體物理作圖、建立特定染色，體文庫、研究單條染色體區(qū)段的結(jié)構(gòu)等方面。培育的種間雜種，作為橋梁物種，有助于增加蘿卜屬和蕓薹屬的雜交親和性，同時有助于轉(zhuǎn)移蘿卜屬中的優(yōu)異性狀到蕓薹屬作物中，豐富作物的育種基礎。目前，鮮見有蕪菁和蘿卜的屬間雜種成功的例子。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術問題是：提出一種創(chuàng)制蕪菁和蘿卜屬間雜種的方法。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提出的技術方案是：一種創(chuàng)制蕪菁和蘿卜屬間雜種的方法，具體包括如下步驟：

(1)親本材料的播種：為使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播種蘿卜材料，11月份播種蕪菁材料；

(2)花期雜交授粉：次年3-4月份，以蕪菁為母本，以蘿卜為父本，采用人工去雄、蕾期采用化學藥劑涂抹柱頭的方式進行授粉雜交；

(3)考種：6月中旬，種莢成熟后，陸續(xù)采收、脫莢，統(tǒng)計收獲種子數(shù)量和編號；

(4)組織培養(yǎng)獲得雜種苗：9月中旬，利用組織培養(yǎng)技術對收獲的種子，進行發(fā)芽、生長；

(5)無菌苗馴化；待無菌苗生長至一定大小，根系較壯后，于馴化前一天，揭開瓶蓋進行練苗，移栽至盛裝滅菌營養(yǎng)土的小缽中，遮陽網(wǎng)遮蓋，進行幼苗生長，一周后，移栽入塑料大棚中，進行常規(guī)管理；

(6)雜種形態(tài)學鑒定：采用形態(tài)學的方法，對雜種苗進行鑒定，利用米尺、直尺以及游標卡尺，分別統(tǒng)計其株高、葉形、葉片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊長、雌蕊長，花粉情況，每次測量重復3次；

(7)雜種的細胞學鑒定方法：取花蕾，利用細胞學方法，進行染色體鑒定。

優(yōu)選的，所述步驟1中親本材料的播種方式為穴播，株距為30cm，大小行距為60×80cm；每穴播種2～3粒種子，出苗后，待植株長至5～10cm，進行間苗，每穴保留一株；常規(guī)田間管理。

優(yōu)選的，所述步驟2中的花期雜交授粉具體為：

(1)首先對母本花序進行整理，去除已經(jīng)開放的花以及花序中間特別小的花蕾，保留花序外圍，未開放的大花蕾，進行剝蕾、去雄；

(2)使用質(zhì)量濃度為60mg/L的GA3對授粉前母本柱頭進行滴浸；

(3)取父本植株上，新開放的新鮮花粉，涂抹柱頭，授粉后套袋，并掛牌標記雜交組合、授粉時間。

優(yōu)選的，所述步驟4中的組織培養(yǎng)獲得雜種苗的具體步驟為：

(1)種子首先進行70％乙醇處理1min；

(2)6％次氯酸鈉溶液處理15min；

(3)無菌水沖洗4～5次；

(4)無菌濾紙吸干種子上殘存水分；

(5)接種于1/2MS培養(yǎng)基上，每瓶接種10～15粒種子；

(6)放置在組織培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：室溫25℃，光照時間為16h/d，光照強度為2000lux條件下培養(yǎng)，獲得無菌苗。

優(yōu)選的，所述步驟7中的雜種的細胞學鑒定方法的具體步驟為：

(1)取花序中間小花蕾，用改良卡諾固定液，乙醇：氯仿：乙酸＝5:2:3進行固定，一天后更換新的固定液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)制片，從花序上挑取直徑為0.5～1mm的小花蕾，解剖鏡下剝出花藥，轉(zhuǎn)移至70％乙醇中，后吸出花藥，蒸餾水沖洗后，保留花藥；

(3)使用4％的纖維素酶RS和4％的果膠酶Y-23混合溶液，37℃酶解2h 10min；