技術領域

本發明涉及一種檢測人EGFR、KRAS、BRAF基因突變的引物及其試劑盒，屬于分子生 物學檢測技術領域。

背景技術

根據世界腫瘤研究治療領域權威機構NCCN推薦，肺癌患者，尤其是非小細胞肺癌 (NSCLC)患者，建議進行EGFR基因突變檢測。EGFR激活突變的存在對選擇治療用抗癌 藥物具有重要作用。而研究表明，EGFR的某些突變，尤其是它的19號外顯子缺失突變，21 號外顯子點突變(L858R)，18號外顯子點突變，20號外顯子的點突變(T790M)，與絡氨酸 激酶抑制劑(TKIs)的療效有高度的相關性。此外，在部分肺癌病人當中，同時存在著EGFR 基因和KRAS基因的突變，而KRAS基因第2，3，4號外顯子上的突變與絡氨酸激酶抑制劑 (TKIs)的療效有負相關作用，當KRAS基因存在這些類型突變時，會對靶向EGFR的靶向 抗癌藥物產生抵抗。同時，BRAF基因在肺癌當中也存在不同程度的突變。這些突變中最主 要的是第1799位核苷酸上的突變，導致纈氨酸突變成谷氨酸(V600E)，使患者對抗體類藥 物(如西妥昔單抗)產生抗藥性。因此，檢測EGFR、BRAF、KRAS基因的突變情況對指導 臨床腫瘤用藥具有重要作用。

在檢測人組織細胞樣本中EGFR、KRAS、BRAF基因突變的現有技術中，通常采用探針 技術對上述基因突變進行檢測(如廈門艾德生物醫藥科技有限公司生產的EGFR基因檢測試 劑盒)。采用熒光探針技術雖然能夠提高檢測的特異性，但是使用成本過高，同時無法檢測新 型突變。另外采用熒光探針，通過突變組探針熒光起峰的Ct值大小進行判斷的方法，其缺陷 在于沒有有效參照物，雖然引入了內參，但是內參與突變位點并不是同一位點，甚至不是同 一種基因。而且，其Ct值的判斷規則基于經驗值，因此在檢測時由于樣本提取質量等因素， 其檢測效果并不理想，在實際應用中，可能會出現檢測結果的不一致。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種檢測人EGFR、KRAS、BRAF基因突變的 引物試劑盒。本發明的試劑盒采用ARMS-PCR技術對上述基因突變進行檢測，在ARMS-PCR 技術中采用SYBR熒光方法，能夠大幅降低成本；同時通過優化引物設計，在熒光收集階段 引入四步法(81℃收集熒光)，采用高性能的DNA聚合酶，最大限度減少非特異干擾，提高 檢測的可靠性和準確性。

此外，本發明的試劑盒還引入了雙內參系統，提供了雙重判讀規則，提高了檢測的準確 性和靈敏度。

本發明中，所述EGFR、KRAS、BRAF基因突變的突變位點信息如下：

為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：

根據本發明的第一方面，提供一種檢測人EGFR、KRAS、BRAF基因突變的ARMS引 物，所述ARMS引物的序列如SEQIDNO.1至SEQIDNO.31所示。

上述ARMS引物中，對于EGFR、KRAS和BRAF基因每一突變位點的檢測都包括有3 條引物，其中：一條用于擴增正常位點，一條用于擴增突變位點，一條作為共用引物。

上述ARMS引物在制備檢測人EGFR、KRAS、BRAF基因突變的試劑盒中的應用也是 本發明的保護范圍。

根據本發明的第二方面，提供一種檢測人EGFR、KRAS、BRAF基因突變的試劑盒，包 括：上述用于檢測人EGFR、KRAS、BRAF基因突變的ARMS引物和用于擴增第一內參的 引物；

所述第一內參為GAPDH基因，用于擴增第一內參的引物序列如SEQIDNO.32和SEQID NO.33所示。

所述ARMS引物中，用于擴增正常位點的引物和共用引物擴增得到對應突變位點的正常 基因位點，作為第二內參。

上述試劑盒中，還包括如下試劑：DNA聚合酶、10×DNA聚合酶緩沖液、SYBR-Green-I、 高純水、陽性對照品和4種dNTP混合物。

優選的，所述DNA聚合酶為TaqHSDNA聚合酶。

進一步的，上述試劑盒中還包括用于對樣品進行桑格測序的試劑，所述試劑中包含用于 擴增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意一個、兩個或全部的一個或多個外顯子區域的擴增 引物對。

其中，用于擴增EGFR基因的外顯子18的區域的擴增引物對如SEQIDNO.34和SEQID NO.35所示；