技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，特別涉及一種誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的方法和 樹(shù)突狀細(xì)胞。

背景技術(shù)

細(xì)胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法， 彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療的弊端，已經(jīng)被公認(rèn)為二十一世紀(jì)腫瘤綜合 治療模式中最活躍、最有發(fā)展前途的一種治療手段,也是世界目前唯一有希望 完全消滅腫瘤細(xì)胞的治療手段。

細(xì)胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，使其數(shù)量 成千倍增多，靶向性殺傷功能增強(qiáng)，然后再回輸?shù)饺梭w來(lái)殺滅血液及組織中 的病原體、癌細(xì)胞、突變的細(xì)胞，打破免疫耐受，激活和增強(qiáng)機(jī)體的免疫能 力，兼顧治療和保健的雙重功效。目前在臨床中使用最多的細(xì)胞免疫治療療 法主要是DC治療、CIK治療和DC-CIK聯(lián)合免疫治療。

DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigenpresenting cell,APC)，一方面，其能夠刺激初始的T細(xì)胞增殖，啟動(dòng)免疫應(yīng)答；另一 方面，樹(shù)突狀細(xì)胞還能夠呈遞抗原給MHC-I類限制性CD8+和MHC-II類 限制性CD4+T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，被稱為“天然免疫佐劑”， 因此，樹(shù)突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中具有獨(dú)特的地位。

近年來(lái)，以樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療及DC 疫苗已取得較大進(jìn)展，體外制備的DC疫苗顯示出明顯誘發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答 的能力，具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前，從外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)經(jīng) GM-CSF、IL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的方法已基本得到公認(rèn)，但DC體外促成 熟的方案尚沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)主要采用TNF-a因子，但該方法活化的 DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12，致使培養(yǎng)得到的DC功能缺陷， 很大程度上限制了DC疫苗的臨床應(yīng)用工作的開(kāi)展。因此，有必要對(duì)現(xiàn)有DC 細(xì)胞培養(yǎng)方案進(jìn)行進(jìn)一步完善，以有效提高DC疫苗在誘導(dǎo)抗炎或抗腫瘤免 疫應(yīng)答中的作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)出的樹(shù)突狀細(xì)胞體外 誘導(dǎo)成熟率低，細(xì)胞增殖率低，且抗原提呈性能差等缺陷，提供一種能夠提 高樹(shù)突狀細(xì)胞成熟率及抗原提呈性能的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：提供一種誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞 成熟的方法，包括以下步驟：

獲取樹(shù)突狀細(xì)胞前體單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)第一誘導(dǎo)劑培養(yǎng)4～7天，每隔2～3 天更換培養(yǎng)基，獲得未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；

然后，再添加第二誘導(dǎo)劑培養(yǎng)所述未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞2～4天至樹(shù)突狀細(xì) 胞成熟；

其中，第一誘導(dǎo)劑包括：rhGM-CSF、GM-CSF、IL-4、rhIL-4和IL-13；

第二誘導(dǎo)劑包括rhTNF-α、沒(méi)食子酸或核桃青皮提取物。

在本發(fā)明提供的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的方法中，所述第一誘導(dǎo)劑中， rhGM-CSF的濃度為800～1200U/ml、GM-CSF的濃度為5～15ng/mL、IL-4 的濃度為5～15ng/mL、rhIL-4的濃度為800～1200U/ml和IL-13的濃度為 5～15ng/mL。

在本發(fā)明提供的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的方法中，所述第一誘導(dǎo)劑中， rhGM-CSF的濃度為1000U/ml、GM-CSF的濃度為10ng/mL、IL-4的濃度 為10ng/mL、rhIL-4的濃度為1000U/ml和IL-13的濃度為10ng/mL。

在本發(fā)明提供的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的方法中，所述第二誘導(dǎo)劑中， rhTNF-α的濃度為800～1200U/ml、沒(méi)食子酸5～15μg/ml，或核桃青皮提取 物的濃度為10～30μg/ml。

在本發(fā)明提供的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的方法中，所述第二誘導(dǎo)劑中， rhTNF-α的濃度為1000U/ml、沒(méi)食子酸10μg/ml，或核桃青皮提取物的濃 度為20μg/ml。

在本發(fā)明提供的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的方法中，所述樹(shù)突狀細(xì)胞前體單 個(gè)核細(xì)胞來(lái)源于外周血。

在本發(fā)明提供的誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的方法中，所述樹(shù)突狀細(xì)胞前體單 個(gè)核細(xì)胞的獲取過(guò)程，包括以下步驟：