技術領域

本發明涉及一種海水養殖貝類的種類鑒定技術領域，尤其是一種利用形態學和分 子遺傳學技術對貝類樣品進行種類鑒定的方法。

背景技術

通過對貝類資源的調查研究，可以獲得貝類數量、種類、分布等資料，對貝類資源 的保護和合理開發利用具有重要意義。準確的鑒定貝類種類，是開展貝類種質資源相關研 究的基礎。

我國已有的關于貝類種類鑒定和形態特征資料，主要是通過野外采集貝類，利用 形態特征確定種類。通常，同科不同種的貝類在同一養殖環境下，外形特征比較相似，單純 通過形態學特征區分物種，能鑒定的種類非常有限。

另外，利用分子生物學方法進行的物種鑒定、克服了形態學法鑒定主觀性強的缺 點，同時，還具有靈敏度高、重復性好、操作方便等優點，已在貝類種質鑒定中廣泛應用。然 而，分子生物學方法也存在DNA提取、PCR擴增耗時長的缺點，且檢測基因序列的費用較高， 不適宜對大量的樣品進行逐一鑒定。

福爾馬林溶液具有良好的防腐、固定效果，是貝類種質資源調查中被廣泛使用的 保存液。但是由于福爾馬林對DNA分子的化學修飾作用，會給樣品的DNA提取和擴增帶來較 大的困難，因此通常使用70％乙醇固定保存。然而乙醇強烈的脫水作用會導致樣品收縮、變 硬，形態發生顯著改變，不利于形態學觀察。建立一種既能很好的保存樣品的形態特征，又 能相對容易的提取、擴增樣品DNA的貝類種質保存方法，是應用形態學與分子生物學方法相 結合，對貝類種質進行種類鑒定的前提。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種形態學與分子生物學方法相結合鑒 定貝類種質的方法。該方法易行，操作簡便，將形態學方法與分子生物學方法有機結合起 來，很好地解決了種類鑒定的技術難題，為貝類種質鑒定研究提供了技術支持。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種形態學與分子生物學相結合 鑒定貝類種質的方法，其特征在于，包括以下步驟：①將可以準確鑒定種類的貝類樣品保存 于70％乙醇溶液中，常規方法提取DNA，擴增線粒體DNA的COI片段并測序，

通用引物序列

LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′

HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′

②將采集的樣品保存于4％的福爾馬林溶液中，

③樣品形態學鑒定，在解剖鏡下將不能準確確定種類的樣品依據形態特征歸類， 從每一類中選取具有代表性的個人進行顯微拍照，記錄形態特征，該形態特征包括殼高、殼 長、殼寬、總重、殼重、殼厚、背緣長、外韌帶長、殼頂寬、放射肋寬、絞合齒數、放射肋條數，

④分子生物學鑒定，將選出的樣品提取DNA，擴增線粒體DNA的COI基因片段并測 序，將測序結果與BOLDSystems(http://www.boldsystems.org/index.php/IDS_OpenIdEngine)Animalidentification[COI]進行數據比對，確定該種貝類的分類學地位， 并建立Barcoding數據庫，

(1)DNA提取

采用常規的蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇抽提，無水乙醇沉淀的方法提取基因組 DNA；用瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用紫外分光光度計檢測DNA純度與濃度，選取電泳條帶較亮 且濃度較高的DNA稀釋成統一濃度，保存于4℃冰箱中用于后續實驗。提取DNA的具體過程如 下：

a)切取貝類組織50～100mg，放入1.5mL滅菌離心管中用剪刀剪碎；

b)加裂解液500μL再加入5μL蛋白酶K，上下顛倒混勻，40℃水浴槽內消化過夜；

c)加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿、異戊醇混合液500μL，放于旋轉培養器中混勻 20min；

d)室溫離心15min，5000r/min，用移液槍吸取上清液于另一離心管內；

e)重復c～d步驟3次；

f)加入與上清液等體積的氯仿∶異戊醇混合液，置于旋轉培養器混勻20min，該氯 仿∶異戊醇混合液的體積比為24∶1；

g)室溫離心15min，5000r/min，用移液槍吸取上清液于另一離心管中；