1.一種形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合鑒定貝類種質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下步驟： ①將可以準(zhǔn)確鑒定種類的貝類樣品保存于70％乙醇溶液中，常規(guī)方法提取DNA，擴(kuò)增線粒體 DNA的COI片段并測(cè)序，

通用引物序列

LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′

HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′

②將采集的樣品保存于4％的福爾馬林溶液中，

③樣品形態(tài)學(xué)鑒定，在解剖鏡下將不能準(zhǔn)確確定種類的樣品依據(jù)形態(tài)特征歸類，從每 一類中選取具有代表性的個(gè)人進(jìn)行顯微拍照，記錄形態(tài)特征，該形態(tài)特征包括殼高、殼長(zhǎng)、 殼寬、總重、殼重、殼厚、背緣長(zhǎng)、外韌帶長(zhǎng)、殼頂寬、放射肋寬、絞合齒數(shù)、放射肋條數(shù)，

④分子生物學(xué)鑒定，將選出的樣品提取DNA，擴(kuò)增線粒體DNA的COI基因片段并測(cè)序，將 測(cè)序結(jié)果與BOLDSystemsAnimalidentification[COI]進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，確定該種貝類的 分類學(xué)地位，并建立Barcoding數(shù)據(jù)庫(kù)，

(1)DNA提取

a)切取貝類組織50～100mg，放入1.5mL滅菌離心管中用剪刀剪碎；

b)加裂解液500μL再加入5μL蛋白酶K，上下顛倒混勻，40℃水浴槽內(nèi)消化過夜；

c)加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿、異戊醇混合液500μL，放于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器中混勻 20min；

d)室溫離心15min，5000r/min，用移液槍吸取上清液于另一離心管內(nèi)；

e)重復(fù)c～d步驟3次；

f)加入與上清液等體積的氯仿∶異戊醇混合液，置于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器混勻20min，該氯仿∶異 戊醇混合液的體積比為24∶1；

g)室溫離心15min，5000r/min，用移液槍吸取上清液于另一離心管中；

h)重復(fù)f～g步驟3次；

i)向得到的上清液中加入10μL醋酸鈉，再加入2.5倍上清液體積的無水乙醇，顛倒混 勻，無水乙醇于-20℃預(yù)冷處理；

j)將步驟i中的混合液放置于-20℃過夜；

k)4℃離心，12000r/min，15min后倒掉上清液加70％乙醇1000μL，12000r/min，1min離 心；

l)重復(fù)上述步驟k一次；

m)倒掉上清液加無水乙醇1000μL，12000r/min，1min離心，倒掉上清液，風(fēng)干；

n)加入50～100μLTE緩沖液，溶解DNA；

(2)目的片段的擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為15μL，包含100ng模板DNA，1×PCR緩沖液，0.4UTaqDNA聚合酶，2.5mM MgCl₂，0.25mMdNTP混合液，上下游引物各0.7μM，滅菌的雙蒸水將體系補(bǔ)至15μL。

PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，然后30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括3個(gè)步驟：94℃30S；49 ～56℃退火30S；72℃延伸45S，PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，DL2000DNAMarker作為檢 測(cè)產(chǎn)物大小，凝膠成像儀拍照，讀取PCR擴(kuò)增結(jié)果；

(3)目的片段測(cè)序及比對(duì)

將符合預(yù)期長(zhǎng)度大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后，與貝類的在線 數(shù)據(jù)庫(kù)BOLDSystemsAnimalidentification[COI]進(jìn)行比對(duì)，確定該貝類的分類學(xué)地位。