本發(fā)明公開(kāi)了一種李痘病毒主要株系雜交探針及基因芯片的制備方法，所述探針包括：PPV?D；PPV?M；PPV?EA；PPV?Rec；PPV?W；PPV?C。一種基因芯片的制備方法，其特征在于包括以下步驟：制備基因芯片點(diǎn)樣；PCR擴(kuò)增與樣品標(biāo)記；芯片預(yù)處理；芯片的雜交；芯片的清洗；芯片的掃描分析；數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定。本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種用于檢測(cè)李痘病毒主要株系雜交探針；本發(fā)明還涉及一種包括上述探針的基因芯片的制備方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于李痘病毒主要株系雜交探針，本發(fā)明還涉及一種包括該探針的基因芯片的制備方法，本發(fā)明還涉及一種采用上述基因芯片檢測(cè)李痘病毒的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

李痘病毒Plum pox virus,PPV是我國(guó)2007年頒布的進(jìn)境植物檢疫性有害生物，是核果類果樹(shù)危險(xiǎn)性最大的病毒之一，屬于馬鈴薯Y病毒科Potyviridae中的馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus，其自然寄主主要是李屬的木本植物，侵染李、杏、桃、櫻桃等核果類果樹(shù)后，使葉片和果實(shí)均受到嚴(yán)重危害，未成熟果實(shí)大量脫落，造成果實(shí)品質(zhì)下降，產(chǎn)量降低。病毒遠(yuǎn)距離擴(kuò)散則主要靠感染病毒的植物繁殖材料的調(diào)運(yùn)。根據(jù)病毒的來(lái)源和侵染植物的不同，該病毒的目前主要株系有6個(gè)，它們分別為PPV-D,PPV-M，PPV-C,PPV-EA,PPV-W,PPV-Rec，其中D株系和M株系是目前最主要的流行株系。

廣東地處我國(guó)的南方開(kāi)放地區(qū),地理環(huán)境優(yōu)越,每年經(jīng)過(guò)廣東轄區(qū)口岸的進(jìn)出境種子、苗木等容易攜帶該病毒的材料數(shù)量眾多,由于進(jìn)出境批次多,數(shù)量龐大,急需研究出即能保證檢測(cè)速度快、靈敏度要高、而且檢測(cè)通量高的方法,由于苗木帶毒率低，只有加大樣品的抽樣量才能避免漏檢和保證檢測(cè)率，而對(duì)于大量樣品的檢測(cè)，就必須有檢測(cè)高通量的儀器設(shè)備和方法，本課題就是針對(duì)這一病毒檢測(cè)的要求，利用基因芯片技術(shù)來(lái)研究李痘病毒主要不同株系的檢測(cè)方法，以便最大限度的提高該病毒的檢出率和防止漏檢，對(duì)保證我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)健康的發(fā)展具有非常重要的意義。

目前無(wú)論國(guó)外國(guó)內(nèi)，植物病毒的檢測(cè)方法主要有如下4種：一是傳統(tǒng)的生物學(xué)方法，其特點(diǎn)是周期長(zhǎng)，準(zhǔn)確度低，檢測(cè)病毒數(shù)量少，勞動(dòng)強(qiáng)度大，；二是電子顯微鏡方法，但它只能觀察病毒粒體形態(tài)，不能鑒定病毒種類，而且操作復(fù)雜，價(jià)格十分昂貴；三是酶聯(lián)免疫吸附分析法，是目前應(yīng)用最廣的病毒檢測(cè)方法，但其檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，操作步驟多，而且需要專用儀器和購(gòu)買昂貴的特異性抗血清；四是PCR方法雖然靈敏度非常高且快速，但更需要專用儀器和專業(yè)人員，而且檢測(cè)通量非常有限。

由于植物病毒的特殊性，即一般種子和苗木帶毒率是非常低的，加上進(jìn)出境量通常非常之多，如果抽樣量過(guò)少，則漏檢的機(jī)率就一定非常之大，把關(guān)作用就會(huì)大大消弱；為了最大限度的提高檢測(cè)率，避免漏檢，就必須加大抽樣量，這樣就會(huì)導(dǎo)致樣品眾多，不僅會(huì)加大檢測(cè)的工作量，而且會(huì)極大的影響檢測(cè)速度，推遲通關(guān)速度，進(jìn)而影響進(jìn)出境貿(mào)易的正常進(jìn)行，因此急需具有高通量檢測(cè)的儀器設(shè)備和方法，而基因芯片技術(shù)正好適合這一要求。

基因芯片gene chip的最早是80年代中期提出的，其本質(zhì)上仍然是核酸分子雜交方法，具體系指將大量，通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400，探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷虾笈c標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。基因芯片技術(shù)由于同時(shí)將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對(duì)樣品大量序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交Southern Blotting和Northern Blotting等技術(shù)操作繁雜、自動(dòng)化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測(cè)效率低等不足；而且，通過(guò)設(shè)計(jì)不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價(jià)值，如基因表達(dá)譜測(cè)定、實(shí)變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因組文庫(kù)作圖及雜交測(cè)序等。

目前基因芯片技術(shù)已經(jīng)在許多方面得到了廣泛的應(yīng)用，但是在李痘病毒主要不同株系檢測(cè)鑒定方面還未見(jiàn)諸報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種用于檢測(cè)李痘病毒主要株系雜交探針；