1.一種采用基因芯片檢測李痘病毒的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、制備基因芯片點樣：

取5μl純化探針，加點樣液5μl混勻，探針濃度為10μM；加到點樣儀，將寡核苷酸探針點在醛基玻片上，并通過探針5’末端的氨基基團進行共價固定；

其中所述探針為：

PPV-D：5’- CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA-3’

PPV-M：5’- CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG-3’

PPV-EA：5’- CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT-3’

PPV-Rec：5’- CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG-3’

PPV-W：5’- GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT-3’

PPV-C：5’- ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG-3’；

B、PCR 擴增與樣品標記：

B1、感病植物總RNA 提取：

稱取0.1g 感病植物組織樣品，然后按照Trizol試劑盒方法提取樣品總RNA；

B2、反轉錄：

在裝有去離子水9.5μL 的0.2mL PCR 管中，加入B1 中提取的樣品總RNA 2μL，Oligo(dT)15 0.5μL，dNTPs 1μl ，混合均勻，70℃ 水浴 5min 后立即置于冰上2min，3000rpm 離心30 秒后加入5×cDNA第一鏈合成緩沖液4μL，0.1mol/L DTT 1μL，RNase抑制劑 1μL，M-MLV反轉錄酶1μL，40℃水浴60min；

B3、 PCR 擴增：

在0.2mL PCR 管中，加入10×PCR 擴增緩沖液2.5μL， dNTPs 1μL，Cy3 標記的PPV-chip-P1 1μmol/L，Cy3 標記的PPV-chip-P2 1μmol/L，反轉錄合成反應液2μL，加水至25μL，Taq聚合酶 0.5μL；94℃ 3 分鐘；94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 1min，循環35 次；72℃ 10min；4℃保存；

C、芯片預處理：

點樣儀中干燥好芯片于65℃烘箱中固定1h，將芯片點有DNA 的一面在60℃水浴鍋上水合10s，芯片距水面距離2-3cm，在空氣中室溫自然干燥后，再進行一次水合，之后將點有探針的一面朝上，放在紫外交聯儀中250mJ 交聯，后再將芯片放在42℃預熱的0.5% SDS 中洗滌10min，再用42℃預熱的蒸餾水清洗4min，最后用無水乙醇清洗2min，2000rpm 離心5min去除芯片表面的液體后，密封，室溫保存備用；

D、芯片的雜交：

制備好芯片放置在雜交盒中，將標記樣品與雜交液的混合物混勻后，3000rpm，離心30s，于95℃沸水中變性處理3min，冰浴驟冷1min，然后用移液器將雜交混合液分別加注到雜交芯片的蓋片上的小孔中，使預雜交液覆蓋于點樣區，然后蓋緊雜交盒的蓋，放入42℃的水浴中，雜交2h，使樣品與探針充分混合；

E、芯片的清洗：

雜交結束后，在暗室內取出芯片，雜交面朝上放于清洗盒中，放在水平搖床上用42℃預熱洗液1 清洗4min，以便洗去沒有與探針特異性結合的樣品；然后迅速地用鑷子將芯片轉移到盛放有洗液2 的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上用42℃預熱洗液2 清洗4min，清洗結束后，1500rpm，1min 離心干燥，除去玻璃表面上的液體；

F、芯片的掃描分析：

步驟E 清洗完畢4 小時內進行掃描，利用基因芯片激光共聚焦掃描儀掃讀芯片信息；

G、數據處理與結果判定：

掃描后圖像將通過判讀軟件自動進行分析，通過比較分析信號中位值和信號平均值的輸出數據，以其中最能反映芯片雜交圖像信息的參數值進行結果分析，當芯片上呈現綠色信號且HEX 質控信號呈現綠色信號時即可判定陽性反應，對于反應強烈的直接從掃描圖片上熒光的反應判斷檢測結果；

其中步驟D 中配制的雜交混合液包括100%甲酰胺 5μl ，10% SDS 0.2μl ，20 X SSC1.5μl ，PCR 樣品標記物3.3μl，共10μl；

步驟F 中利用基因芯片激光共聚焦掃描儀掃讀芯片信息的具體步驟：先打開掃描軟件，然后開倉，將芯片插入機器內，關倉，使用綠色熒光通道，先使用4 偽彩進行預掃一次，以便選擇掃描區域，再進行精掃，掃描參數為掃描分辯率為10μm，激發光源波長532nm，接收的熒光信號中心波長570nm，檢測靈敏度小于一個熒光分子/μm²，激光功率值Laser Power100%，光電倍增管效率值PMT Gain 600；

步驟B3 中所述PPV-chip-P1 的序列為：

5’- CCCATTTTCACRCCAGCARC -3’ Tm=61.8；其中R 表示堿基G 或者A；

所述PPV-chip-P2 的序列為：5’- TCGCATGATCCAACAATGGC -3’ Tm=59.8 。