技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高分子藥物載體領(lǐng)域，具體涉及一種葉酸/生物素修飾的殼聚糖材料及其制備方法。

背景技術(shù)

殼聚糖來(lái)源于天然的動(dòng)物甲殼，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均十分接近天然的多糖，具有良好的生物相容性、天然可降解性及對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，且易溶于酸性環(huán)境下的水溶液，因此成為研究的熱門，尤其是作為藥物控釋載體而受到極大的重視。殼聚糖分子鏈中含有大量的活潑氨基，可與多種親電試劑進(jìn)行反應(yīng)，形成穩(wěn)定的化學(xué)接枝，這種便于改性的特點(diǎn)進(jìn)一步增強(qiáng)了殼聚糖的實(shí)用性，其中利用配體對(duì)其進(jìn)行共軛接枝從而與細(xì)胞表面受體形成特異性識(shí)別的方法是目前靶向載藥研究領(lǐng)域的常用手段。已被較多研究的生物素和葉酸作為上述配體種類中的典型，在應(yīng)用于殼聚糖抗癌藥物載體的靶向改性中各自均能達(dá)到較佳的實(shí)驗(yàn)效果，由二者之一修飾的殼聚糖納米載體均在一定程度上對(duì)肝癌細(xì)胞構(gòu)成主動(dòng)靶向，并在載藥的情況下主要對(duì)病變組織產(chǎn)生藥效，而基本上不會(huì)傷害正常細(xì)胞，但利用生物素與葉酸作為雙配體的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種合成周期短、反應(yīng)效率高的葉酸/生物素修飾的殼聚糖材料及其制備方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

提供一種葉酸/生物素修飾的殼聚糖材料，所述葉酸/生物素修飾的殼聚糖材料以殼聚糖為載體，葉酸和生物素為配體，利用N-酰化反應(yīng)制備葉酸/生物素修飾的殼聚糖材料，其結(jié)構(gòu)式如下：

按上述方案，所述殼聚糖分子量為20000-50000，脫乙酰度≥85％。

按上述方案，所述葉酸/生物素修飾的殼聚糖材料中葉酸和生物素的接枝率均≥5％。

本發(fā)明葉酸/生物素修飾的殼聚糖材料的制備方法步驟如下：

1)制備殼聚糖溶液：將殼聚糖溶于醋酸溶液中，得到濃度為5-10mg/mL的殼聚糖溶液，并調(diào)節(jié)pH值至4.7-6.0，備用；

2)制備琥珀酰亞胺基生物素酯：將DCC、NHS與生物素按摩爾比1.2-1.5:1:1混合后于50-60℃條件下反應(yīng)16-24h，過(guò)濾后在冰浴條件下向?yàn)V液中滴加乙醚析出沉淀，然后用異丙醇對(duì)沉淀進(jìn)行重結(jié)晶，過(guò)濾收集結(jié)晶并用DMF溶解結(jié)晶，過(guò)濾后逐滴加入無(wú)水乙醚中，冷藏過(guò)夜，移走上清液，室溫下真空干燥得到琥珀酰亞胺基生物素酯，備用；

3)制備具有氨基反應(yīng)活性的葉酸活性酯溶液：將葉酸溶于無(wú)水DMSO中，并加入EDC.HCl，在避光條件下于25-40℃磁力攪拌反應(yīng)1-4h，得到葉酸活性酯溶液，濃度以葉酸質(zhì)量濃度計(jì)為26-44mg/mL，備用；

4)將步驟2)所得琥珀酰亞胺基生物素酯溶于DMF中，得到濃度為20-34mg/mL的生物素酯溶液，在磁力攪拌條件下，將生物素酯溶液緩慢加入步驟1)所得殼聚糖溶液中，在室溫條件下反應(yīng)至反應(yīng)液澄清，然后在攪拌條件下緩慢加入步驟3)所得葉酸活性酯溶液，在室溫下繼續(xù)反應(yīng)12-24h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液移入透析袋(透析袋截留分子量為8000)，于蒸餾水中透析3d，每6h換水一次，透析后經(jīng)冷凍干燥即得到葉酸/生物素修飾的殼聚糖材料。

按上述方案，步驟3)所述葉酸與EDC.HCl的摩爾比為1:5-10。

按上述方案，步驟4)所述琥珀酰亞胺基生物素酯與殼聚糖的摩爾比為20-30:1；所述葉酸活性酯與殼聚糖的摩爾比為20-30:1。

本發(fā)明原理在于：生物素與葉酸分子中均包含羧基結(jié)構(gòu)，可與殼聚糖分子鏈上的氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵，但是羧基的酰化作用較弱，須經(jīng)過(guò)活化生成中間反應(yīng)物后，方能與氨基進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。

反應(yīng)機(jī)理如下(式1-3)：

式1琥珀酰亞胺基生物素酯的合成

式2葉酸活性酯的合成

式3葉酸/生物素修飾的殼聚糖材料的合成

本發(fā)明的有益效果在于：1、本發(fā)明通過(guò)先后加入活性生物素酯和活性葉酸酯與殼聚糖反應(yīng)一次合成雙配體(葉酸/生物素)修飾的殼聚糖材料，接枝率高，反應(yīng)時(shí)間較兩步法大大縮短；2、本發(fā)明制備的葉酸和生物素共同修飾的殼聚糖材料能夠滿足納米顆粒載體對(duì)癌細(xì)胞的靶向性要求，作為一種潛在的靶向抗癌藥物載體材料，理論上比具單一配體靶向識(shí)別作用的載體對(duì)癌細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)的相應(yīng)糖蛋白受體有更強(qiáng)的特異性識(shí)別作用、靶向性更可靠。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所制備的葉酸/生物素修飾的殼聚糖材料(FA-CS-Bio)與殼聚糖(CS)的紅外圖譜；