本發(fā)明是重組多肽產(chǎn)生的領(lǐng)域。本文更精確地報(bào)道了使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核菌株在化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中重組產(chǎn)生非糖基化多肽的方法。

發(fā)明背景

近年來，治療性多肽的生產(chǎn)穩(wěn)步增加并且很可能的是在不久的將來治療性多肽將成為可用于治療多種疾病的最大治療組。治療性多肽的影響來自其特異性，如特定的靶標(biāo)識(shí)別和/或結(jié)合功能。

細(xì)胞培養(yǎng)用于發(fā)酵過程中以產(chǎn)生物質(zhì)，特別是多肽。在其中細(xì)胞培養(yǎng)物未被遺傳修飾并且形成其自身的代謝產(chǎn)物的過程與其中生物以它們產(chǎn)生更大量的其自身物質(zhì)如多肽或產(chǎn)生外源物質(zhì)的這種方式被遺傳修飾的過程之間進(jìn)行區(qū)分。利用保證生物存活并使得能夠產(chǎn)生想要的靶標(biāo)化合物的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基供應(yīng)產(chǎn)生物質(zhì)的生物。許多培養(yǎng)基因使得能夠最優(yōu)培養(yǎng)特定宿主的這些目的而聞名。

化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基在培養(yǎng)重組細(xì)胞中用于重組產(chǎn)生治療性多肽中的使用是有利的。其使得能夠?yàn)樗a(chǎn)生的治療性多肽容易地開發(fā)下游加工和純化，由于最小化的原材料差異提供最穩(wěn)健的生產(chǎn)過程并降低產(chǎn)品成本。

化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基不包含游離氨基酸，并且其需要使用原養(yǎng)型的細(xì)胞系，其具有完整的代謝途徑以從化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的可用成分產(chǎn)生所需的氨基酸。

例如，當(dāng)大腸桿菌(E.coli)用作宿主細(xì)胞系時(shí)，一般使用野生型菌株，如MG1655、W3110或BL21。這些菌株顯示良好的生長(zhǎng)特性，但是較次等的產(chǎn)品效價(jià)。

當(dāng)與野生型菌株相比時(shí)，通過非定點(diǎn)誘變和選擇已獲得的突變體原核菌株在其基因組DNA中顯示明顯差異。已經(jīng)基于可以獲得的最大產(chǎn)物效價(jià)選擇了突變株。因?yàn)橥蛔冎陻y帶許多營(yíng)養(yǎng)缺陷型，所以它們不能用于在化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。突變株需要氨基酸的補(bǔ)料以補(bǔ)償其營(yíng)養(yǎng)缺陷型，導(dǎo)致增加的培養(yǎng)成本。

US?5,932,439報(bào)道了大腸桿菌(Escherichia?coli)K-12菌株用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。

發(fā)明概述

通過恢復(fù)營(yíng)養(yǎng)缺陷型原核菌株其一種或多種營(yíng)養(yǎng)缺陷型，所述營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的菌株可以在化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中不再需要向所述化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入對(duì)應(yīng)于已經(jīng)恢復(fù)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的物質(zhì)。在昂貴物質(zhì)的情況下，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品成本的降低并且可以更經(jīng)濟(jì)地產(chǎn)生重組多肽。

除了在缺少對(duì)應(yīng)于已經(jīng)恢復(fù)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的物質(zhì)的情況下恢復(fù)在化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與未恢復(fù)的菌株相比，可以維持或甚至增加可獲得的產(chǎn)物效價(jià)。此外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核菌株可獲得的產(chǎn)物效價(jià)高于利用對(duì)應(yīng)的原養(yǎng)型野生型菌株可獲得的產(chǎn)物效價(jià)。

不希望受該理論束縛，當(dāng)與對(duì)應(yīng)的原養(yǎng)型野生型菌株(其中未曾進(jìn)行該缺失和恢復(fù))相比時(shí)，假定本文報(bào)道的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核菌株具有不同的代謝和代謝流。因此，原核菌株內(nèi)某些酶的失活和再激活對(duì)菌株的完整代謝具有可檢測(cè)的/顯著的影響，其例如可以在與對(duì)應(yīng)的原養(yǎng)型野生型菌株相比該菌株的增加的生產(chǎn)力中看到。

本文報(bào)道的一個(gè)方面是氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核菌株，其特征在于

-已經(jīng)恢復(fù)了必需氨基酸代謝途徑中的至少一種缺陷，和

-菌株可以在化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基不含對(duì)應(yīng)于已經(jīng)在營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核菌株中恢復(fù)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的氨基酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核菌株是營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的大腸桿菌菌株。

本文報(bào)道的一個(gè)方面是氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核菌株，其特征在于

-已經(jīng)恢復(fù)了必需氨基酸代謝途徑中的至少一種缺陷，和

-細(xì)胞可以在化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述化學(xué)成分明確的基礎(chǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基不含對(duì)應(yīng)于已經(jīng)在營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核細(xì)胞中恢復(fù)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的氨基酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核細(xì)胞是營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的大腸桿菌細(xì)胞。

本文報(bào)道的營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核菌株/細(xì)胞可以用于重組產(chǎn)生治療性多肽的方法中，其中與非營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)的原核菌株/細(xì)胞相比，不需要補(bǔ)充至少一種氨基酸殘基。

本文報(bào)道的一個(gè)方面是用于在(重組)原核細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，其包括以下步驟：