技術領域

本發(fā)明涉及一種特異檢測產氣莢膜梭菌腸毒素陽性菌感染的熒光定量PCR檢測試劑盒，屬于細菌核酸檢測領域，適用于臨床及科研中對產氣莢膜梭菌腸毒素陽性的快速定性定量檢測。

背景技術

產氣莢膜梭菌(Clostridium?perfringens)是一種重要的人畜共患病的病原體，廣泛存在于環(huán)境中的土壤、水源、人和動物腸道中。該菌的致病性主要依據(jù)其產生各種毒素的能力，到目前為止，共發(fā)現(xiàn)至少15種以上的產氣莢膜梭菌毒素，除了分型的四種分型致死性毒素α、β、ε、ι毒素外，其中所有型的產氣莢膜梭菌均含有外毒素cpα，還發(fā)現(xiàn)了與人和動物疾病有密切關系的重要的新細菌毒素，如腸毒素(clostridium?perfringens?enterotoxin,CPE)。雖然產腸毒素的產氣莢膜梭菌約占產氣莢膜梭菌的2～5％，但CPE陽性的產氣莢膜梭菌可引起人的食物中毒、抗生素相關腹瀉和散發(fā)性腹瀉等非食源性胃腸疾病及動物胃腸疾病，與食品公共安全息息相關，目前根據(jù)國際最新標準，將檢測樣品中CPE陽性產氣莢膜梭菌作為產氣莢膜梭菌食物中毒的指標。

已有多種免疫學方法用于檢測臨床樣品中的腸毒素，但是存在有檢測的局限性，免疫學檢測方法檢測的是毒素蛋白，易出現(xiàn)假陰性的檢測結果。主要是由于檢測的樣品如腹瀉糞便等腸毒素含量處于較低水平，另一方面由于腸毒素產生于該菌的芽孢階段，在體外培養(yǎng)時，很難形成芽孢產生腸毒素蛋白，因此按照常規(guī)的免疫學檢測方法不能從人工培養(yǎng)物中檢測到。隨著PCR技術的廣泛應用，對產氣莢膜梭菌的檢測從傳統(tǒng)方法過渡到以PCR及雜交探針為主的快速檢測現(xiàn)代方法，目前根據(jù)產氣莢膜梭菌的不同毒素建立了多重PCR檢測方法，可對產氣莢膜梭菌進行檢測與分型。雖然PCR方法靈敏度較高，特異性強，但也有一些缺陷，不能夠檢測極低病毒含量的臨床樣品，如何改進和提高方法的特異性仍有待進一步的研究。

熒光定量PCR檢測技術在普通PCR的基礎上又高了一個新的水平，無論敏感性、特異性與檢測速度都具有顯著優(yōu)勢。但它對引物和探針也提出了更高的要求。產氣莢膜梭菌腸毒素cpe有兩種基因型，一種是位于細菌染色體上，一種是細菌質粒上。

現(xiàn)有技術關于產氣莢膜梭菌抗原、抗體檢測及熒光定量PCR技術的文獻很少，未涉及到產氣莢膜梭菌外毒素cpa和腸毒素cpe的診斷技術。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是建立一種利用熒光定量PCR技術特異檢測含腸毒素cpe產氣莢膜梭菌的熒光定量PCR快速檢測試劑盒，該試劑盒能夠特異靈敏地檢測出產氣莢膜梭菌腸毒素cpe陽性菌，從而達到快速診斷的目的。

本發(fā)明為解決以上技術問題采用的技術方案是：產氣莢膜梭菌腸毒素陽性菌雙重熒光定量PCR快速檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括：a)熒光定量反應液、b)產氣莢膜梭菌外毒素cpa陽性和產氣莢膜梭菌腸毒素cpe陽性質控品、c)陰性質控品；其中熒光定量反應液包含有引物2對和探針1對，為產氣莢膜梭菌外毒素cpa的上游引物cpa01和下游引物cpa02以及熒光探針cpap；產氣莢膜梭菌腸毒素cpe的上游引物cpe01和下游引物cpe02以及熒光探針cpep，其中，

產氣莢膜梭菌外毒素cpa的引物序列為：

上游引物cpa01：5’-GATTTGTAAGGCGCTTATTTGT-3’，

下游引物cpa02：5’-ATAGCATGAGTTCCTGTTCCA-3’，

熒光探針cpap：5’-CTACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTG-3’，探針上游5’端標記的熒光報告基因是TAMRA，3’端標記的熒光淬滅基團是BHQ-2；

產氣莢膜梭菌腸毒素cpe的引物序列為：

上游引物cpe01：5’-AGTGTAAATTAAGCTTTTGAGTCCA-3’，

下游引物cpe02：5’-TAGCTGCTGCTACAGAAAGATTAA-3’，

熒光探針cpep為5’-AAGGGTATGAGTTAGAAGAACGCCAATCA-3’，探針上游5’端標記的熒光報告基因是FAM，3’端標記的熒光淬滅基團是BHQ-1。