技術領域

本發明涉及一種用于精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，以及用于凍存的試管，涉及細胞生物學和醫療器械技術領域。

背景技術

精子DNA完整性檢測，已越來越多的應用于臨床檢測，但畢竟屬于臨床應用較少的檢測，如對新鮮精液的檢測，難以實現批量檢測。

為實現批量檢測精子DNA完整性，需將精子凍存，待收集到一定數量的標本后進行復融，然后批量檢測。輔助生殖技術中的精子凍存和復蘇，需在精液取出30分鐘液化后再添加保護劑，保證有盡可能多的活動精子以利于受精。但是，操作時間過長，會導致部分精子的DNA損傷，而冷凍保護劑里保護精子膜不受損的甘油等成分也會對精子的DNA造成一定程度的損傷。大量研究文獻證明精子凍存技術會導致一定程度的精子DNA損傷，特別是對畸形精子DNA的損傷，這樣凍存后再檢測就不能真實反映凍存前精子DNA完整性情況。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一種用于精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，以及用于凍存的試管。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種用于精子DNA完整性檢測的精子凍存與復融方法，包括以下步驟：

(1)將剛取出的患者精液立即輕輕吹打，取一麥管，先吸入5mm的精子DNA保護緩沖液，再吸入2mm的空氣，然后吸入精液，約0.5ml，然后再吸入2mm的空氣，再吸入5mm的精子DNA保護緩沖液，用加熱法將麥管的液體進入端密封，然后將連接吸管端用木簽(比如尖頭木簽)密封，然后裝入冷凍試管內，旋緊冷凍試管螺紋蓋，裝入紗袋中，立即投入液氮罐中進行冷凍；

所述冷凍試管的結構為：包括管體，管體頂部設有螺紋蓋，管體底部設有鋼塊(目的是增加重量，使試管容易沉入液氮中)，管體的管壁上設有多個小孔(目的是：冷凍時，液氮可快速通過小孔進入試管內，對麥管內的精液進行快速冷凍)。

優選的，所述冷凍試管的管體長25cm，內徑1.5cm，管壁厚度為0.05cm，管壁上遍布直徑為0.2cm的小孔。

優選的，所述管體的材質為聚丙烯材料。

所述麥管為商品化麥氏凍存管。

(2)進行精子DNA完整性檢測前，將冷凍試管從液氮中取出，立即放入37℃水浴中，30秒后取出，打開試管封蓋，取出所有冷凍麥管，用紙巾輕輕擦拭麥管，剪掉采用加熱法密封的密封端，并將此端對準0.5離心管，拔掉另一端的木簽，將精液從木簽端采用吸管吹入離心管；將一個患者所有凍存復融精液混勻后，按體積比1∶1的比例加入精子DNA保護緩沖液，混勻，洗滌精子，然后進行常規的精子DNA完整性檢測。

所述精子DNA保護緩沖液是通過以下方法制備得到的：取8.5克氯化鈉、2.2克磷酸氫二鈉以及0.2克磷酸二氫鈉，溶解于蒸餾水中，定容至1000毫升，調pH值(氫氧化鈉溶液或鹽酸調整)為7.4，即為pH7.4的磷酸緩沖液；取300μl吐溫-20以及0.1克維生素C，加入100毫升磷酸緩沖液中，混勻，即為精子DNA保護緩沖液。

所述洗滌精子的方法如下：凍存復融精液和精子DNA保護緩沖液混勻后，置于10毫升離心管中，以2500轉/分轉速離心5分鐘，棄上清，再加2毫升精子DNA保護緩沖液，混勻，制成精子懸液，待測。

常規方法中，添加冷凍保護劑的主要目的是保護精子膜，以免影響精子的活動力。若不添加保護劑直接凍存精子，會損傷精子膜，精子不再運動，但精子核DNA并不會受損，不會影響精子DNA完整性檢測。本發明的方法在精液取出后不經過液化過程，不添加精子冷凍保護劑，立即裝入精子凍存麥管，縮短了操作時間，盡可能地減少了操作對精子DNA完整性的影響。復融過程中，通過迅速加入具有抗氧化劑成分的緩沖液并洗滌精子，盡快進行精子DNA完整性檢測，就可以真實反映冷凍前精子DNA完整性的水平，從而實現精子DNA完整性檢測的批量操作，進而實現規范化操作。

本發明的方法，不需要添加精子凍存保護劑，不需要等精液液化而直接凍存，步驟簡單，省時。凍存時采用0.5ml精子冷凍麥管，外套本發明特制的四周具有小孔的冷凍試管，能使精子快速冷凍。復融時添加具有抗氧化作用精子DNA保護緩沖液并洗滌精液，以減少操作過程中產生的精子DNA損傷，使精子DNA完整性檢測真實反映冷凍前水平。

附圖說明

圖1：麥管吸入緩沖液和精液并封口的結構示意簡圖。

圖2：冷凍試管的結構示意圖。

其中，1、麥管；2、木簽；3、緩沖液段；4、空氣段；5、精液段；6、管體；7、螺紋蓋；8、鋼塊；9、小孔。