技術領域

本發明屬于水牛繁殖技術領域,尤其涉及一種促進水牛卵母細胞體外成熟的方法。

背景技術

EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)是綠茶主要的活性和水溶性成分，是茶多酚的主要功能物質，因為具有特殊的立體化學結構，具有非常強的抗氧化性和清除自由基的功能。目前，EGCG在醫學上的應用主要是抗癌防癌。有學者研究證明，EGCG能抑制癌細胞生存需要的信號傳遞，與其他抗氧化劑相互作用降低某些致癌物質的活性，清除有害自由基；有利于維持線粒體膜電位的穩定、保護線粒體基因和功能的完整性，還能夠發揮抗腫瘤、降血脂、抗炎、抗衰老、防輻射等一系列生物活性。細胞的新陳代謝和培養環境中產生一系列活性氧基團(reactive?oxygen?species，ROS)，如O₂-、H₂O₂及HO₂-、-OH等，它們會造成DNA和細胞膜損傷，誘導細胞凋亡，使早期胚胎發育停滯。在細胞培養中，EGCG能增強谷胱甘肽、過氧化物酶、過氧化氫酶、酯還原酶、谷胱甘肽-S-轉移酶的活性。在卵母細胞中，谷胱甘肽(GSH)的功能主要是參與抗氧化作用并保護細胞免受活性氧(ROS)的毒性。細胞中GSH的含量通常作為評估卵母細胞成熟質量的重要指標之一。GSH在細胞發育中的主要功能是參與抗活性氧族毒害作用保護卵母細胞。它能促進卵母細胞成熟、受精過程雄原核的產生和早期胚胎發育?，F有的研究表明，EGCG促進卵母細胞成熟，以及對早期胚胎發育所起的促進作用，可能與提高卵母細胞內GSH的濃度有關。

近年來，哺乳動物卵母細胞體外成熟技術取得了巨大進展，形成了一套較成熟的卵母細胞體外成熟技術體系，但與體內成熟相比，仍有許多差距，特別是囊胚率和囊胚質量較低。其可能原因之一就是卵母細胞在體外成熟過程中較體內成熟產生更多的ROS，并且細胞或胚胎離開供體后得不到母體抗氧化劑的保護，過高的ROS破壞細胞培養環境的平衡。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，以提高卵母細胞的體外成熟率和囊胚發育率。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，在水牛卵母細胞體外成熟培養液中添加EGCG。

EGCG在成熟培養液中的濃度為10μmol/L。

成熟培養液的組成為TCM199+26.2mmol/L?NaHCO₃+5mmol/L?Hepes+10％發情牛血清+3％黃牛卵泡液+0.5μg/mL?FSH+5μg/mL?LH+10μmol/L?EGCG，pH為7.2～7.4。

上述促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，包括以下步驟：

(1)卵母細胞的收集

采集屠宰水牛后的廢棄卵巢，置于含0.024g/L青霉素和0.02g/L鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶中，溫度保持在35℃，并于6h內送回實驗室；用手術剪將卵巢周圍的其它組織剪去，生理鹽水洗滌2～3遍，用18號針頭注射器抽取2～8mm卵泡的卵母細胞卵泡液復合物，洗卵液中挑選胞質均勻、周圍有3層以上顆粒細胞完全包裹的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)；

洗卵液的組成為TCM199+5mmol/L?NaHCO₃+20mmol/L?Hepes+600mg/L青霉素和100mg/L鏈霉素；

(2)卵母細胞的成熟

用預先平衡好的含10μmol/L?EGCG的成熟培養液做若干個培養滴，每個滴55μL，將收集到的卵母細胞用含10μmol/L?EGCG的成熟培養液中清洗2～3遍，后置于成熟培養液微滴中，每個滴放20個的卵母細胞，覆蓋礦物油置于培養箱中培養,培養條件為39℃，5％?CO₂和100％濕度；成熟培養后檢查第一極體排出情況，統計成熟率；

成熟培養液的組成為TCM199+26.2mmol/L?NaHCO₃+5mmol/L?Hepes+10％發情牛血清+3％黃牛卵泡液+0.5μg/mL?FSH+5μg/mL?LH+10μmol/L?EGCG，pH為7.2～7.4。

上述促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，還包括以下步驟：

(3)成熟卵母細胞的體外受精