[發明專利]促進水牛卵母細胞體外成熟的方法在審
| 申請號: | 201410614012.3 | 申請日: | 2014-11-04 |
| 公開(公告)號: | CN104312971A | 公開(公告)日: | 2015-01-28 |
| 發明(設計)人: | 張明;李敏玲;陳富美 | 申請(專利權)人: | 廣西大學 |
| 主分類號: | C12N5/075 | 分類號: | C12N5/075;C12N5/073 |
| 代理公司: | 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104 | 代理人: | 楊立華 |
| 地址: | 530004 廣西壯族*** | 國省代碼: | 廣西;45 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 促進 水牛 細胞 體外 成熟 方法 | ||
1.一種促進水牛卵母細胞體外成熟的方法,其特征在于在水牛卵母細胞體外成熟培養液中添加EGCG。
2.根據權利要求1所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法,其特征在于:所述EGCG在成熟培養液中的濃度為10μmol/L。
3.根據權利要求2所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法,其特征在于:所述成熟培養液的組成為TCM199+26.2mmol/L?NaHCO3+5mmol/L?Hepes+10%發情牛血清+3%黃牛卵泡液+0.5μg/mL?FSH+5μg/mL?LH+10μmol/L?EGCG,pH為7.2~7.4。
4.根據權利要求3所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法,其特征在于包括以下步驟:
(1)卵母細胞的收集
采集屠宰水牛后的廢棄卵巢,置于含0.024g/L青霉素和0.02g/L鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶中,溫度保持在35℃,并于6h內送回實驗室;用手術剪將卵巢周圍的其它組織剪去,生理鹽水洗滌2~3遍,用18號針頭注射器抽取2~8mm卵泡的卵母細胞卵泡液復合物,洗卵液中挑選胞質均勻、周圍有3層以上顆粒細胞完全包裹的卵丘-卵母細胞復合體;
所述洗卵液的組成為TCM199+5mmol/L?NaHCO3+20mmol/L?Hepes+600mg/L青霉素和100mg/L鏈霉素,pH為7.2~7.4;
(2)卵母細胞的成熟
用預先平衡好的含10μmol/L?EGCG的成熟培養液做若干個培養滴,每個滴55μL,將收集到的卵母細胞用含10μmol/L?EGCG的成熟培養液中清洗2~3遍,后置于成熟培養液微滴中,每個滴放20個的卵母細胞,覆蓋礦物油置于培養箱中培養,培養條件為39℃,5%CO2和100%濕度;成熟培養后檢查第一極體排出情況,統計成熟率;
所述成熟培養液的組成為TCM199+26.2mmol/L?NaHCO3+5mmol/L?Hepes+10%發情牛血清+3%黃牛卵泡液+0.5μg/mL?FSH+5μg/mL?LH+10μmol/L?EGCG,pH為7.2~7.4。
5.根據權利要求4所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法,其特征在于還包括以下步驟:
(3)成熟卵母細胞的體外受精
體外受精所用精液為冷凍精液,38.5℃水浴解凍,上游法收集活力高的精子;卵母細胞成熟22~24h后,吹打去除COCs周圍的顆粒細胞,卵母細胞用體外受精液洗滌兩次后置于約40μL的受精滴中,每滴約15~20個,每個受精滴注入12μL離心處理好的精液,使其濃度達到1~2×106個/mL,置于培養箱中進行受精培養;受精后第二天將假定受精卵移入單層顆粒細胞中共培養,隔天更換一半胚胎培養液,受精后48h統計卵裂率,第6~9天統計囊胚率;
所述體外受精液的組成為Tyrode’s液+20μg/mL?Heparin?Sodium+2.0mmol/L?Caffeine+6.0mg/mL?BSA,pH7.5~7.8。
6.根據權利要求4所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法,其特征在于還包括以下步驟:
(4)成熟卵母細胞的孤雌激活
采用化學激活法,卵母細胞成熟22~24h后,吹打去除COCs周圍的顆粒細胞,卵母細胞用添加了5μmol/L離子酶素的洗卵液中激活5min,后置于6-DMAP培養液中培養6h,6-DMAP培養液為胚胎培養液中添加2mmol/L的6-DMAP;用胚胎培養液洗滌2~3次,置于單層顆粒微滴中共培養,隔天更換一半胚胎培養液,激活48h后統計卵裂率,第6~9天統計囊胚率。
7.根據權利要求5或6所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法,其特征在于還包括以下步驟:
(5)胚胎培養
體外受精或孤雌激活后的卵母細胞用胚胎培養液洗滌2~3次后,移入顆粒細胞單層培養液微滴中培養,體外培養時間為8天,共培養24h統計卵裂率,第8d統計囊胚率;
所述胚胎培養液的組成為54%體外受精液+36%成熟培養液+10%胎牛血清。
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