技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磷脂型DNA的發(fā)酵制備方法。

背景技術(shù)

二十二碳六烯酸(DHA)是一種重要的omega-3長鏈多不飽和脂肪酸，是大腦和視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞膜的組成成分，具有增強(qiáng)視力、促進(jìn)腦細(xì)胞發(fā)育及預(yù)防高血壓、動脈硬化、心血管疾病等生理功效。由于人體很難通過自身合成來滿足機(jī)體對DHA的需求，因此必須依靠從外界食物中獲取。

目前，DHA的主要來源是魚油，且主要以甘油三酯的形式被人體攝入。DHA的另一種存在形式為磷脂型DHA(DHA-containing PL)。磷脂是生物膜的主要成分，研究表明它具有降血脂，抗動脈粥樣硬化等作用。DHA的存在形式不同，在人體內(nèi)的吸收方式和吸收效率也不同。甘油酯型DHA在人體內(nèi)主要以被動擴(kuò)散的方式被吸收，吸收率為50％左右。而磷脂型DHA在人體內(nèi)主要以主動吸收的方式被吸收，吸收率接近100％。Kafrawy等人研究發(fā)現(xiàn)，與其他磷脂型脂肪酸相比，磷脂型DHA對小鼠白血病細(xì)胞具有更大的毒性。研究還發(fā)現(xiàn)，磷脂型DHA能夠有效降低小鼠血漿和肝臟中的總膽固醇和甘油三酯含量，改善正常小鼠的血脂水平。Gisbert等人研究發(fā)現(xiàn)，磷脂型DHA較甘油酯型DHA而言，對仔魚的生長有更好的促進(jìn)作用。Schaefer等人研究發(fā)現(xiàn)，血漿中磷脂型DHA水平的增加可以有效減少癡呆的發(fā)病率。

磷脂型DHA只存在于蛋黃中，且含量極低。目前，國內(nèi)磷脂型DHA的研究主要集中在以下幾個方面：(1)磷脂型DHA的應(yīng)用；(2)磷脂型DHA的提取；(4)磷脂型DHA的生理作用研究。其中，并未發(fā)現(xiàn)利用生物發(fā)酵法制備磷脂型DHA的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法以填補(bǔ)國內(nèi)空白。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，它包括以下步驟：

(1)以產(chǎn)DHA的菌株為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵，獲得富含甘油脂型DHA的菌體細(xì)胞；

(2)向步驟(1)高密度發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液中添加營養(yǎng)物質(zhì)，繼續(xù)發(fā)酵獲得富含磷脂型DHA的菌體細(xì)胞；

(3)收集步驟(2)得到的富含磷脂型DHA的菌體細(xì)胞，經(jīng)破碎、萃取獲得富含磷脂型DHA的油脂；

其中，所述的營養(yǎng)物質(zhì)為碳源、氮源、磷源、氨基酸中的任意一種或幾種的組合。

其中，所述的產(chǎn)DHA的菌株為裂殖壺菌屬、破囊壺菌屬、吾肯氏壺藻屬，優(yōu)選為裂殖壺菌屬，最優(yōu)選為CCTCC No：M209059菌株(該菌株已經(jīng)公開在申請?zhí)枮?00910033869.5的中國專利中)。

上述步驟(1)中的高密度發(fā)酵包括如下步驟：

(1a)將保存在甘油管中的菌株接入裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20～30℃的搖床中，以150～200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24～48h，獲得一級種子液；

(1b)將步驟(1a)得到的一級種子液按照2～10％v/v接種量接入裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20～30℃的搖床中，以150～200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24～48h，獲得二級種子液；

(1c)將步驟(1b)得到的二級種子液按照2～10％v/v接種量接入裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20～30℃的搖床中，以150～200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24～48h，獲得三級種子液；

(1d)將步驟(1c)中得到的三級種子液按照2～10％v/v接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，然后向發(fā)酵罐中加入消泡劑，進(jìn)行發(fā)酵，使菌株發(fā)酵產(chǎn)富含甘油酯型DHA的油脂。

上述步驟(1d)中發(fā)酵條件的通氣量為0.2～1vvm，優(yōu)選為0.6vvm。

上述步驟(1d)中發(fā)酵條件的攪拌速度為100～200rpm，優(yōu)選為200rpm。

上述步驟(1d)中發(fā)酵條件的罐溫為20～30℃，優(yōu)選為30℃。

上述步驟(1d)中發(fā)酵條件的培養(yǎng)時間為90～150h，優(yōu)選為120h。

上述步驟(1d)中采用的發(fā)酵方法為間歇式發(fā)酵或補(bǔ)料式發(fā)酵方法。

上述高密度發(fā)酵中的種子培養(yǎng)基的碳含量為10～30g/L，優(yōu)選為15～25g/L，最優(yōu)選為20g/L。