[發(fā)明專利]一種磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410547056.9 | 申請日: | 2014-10-15 |
| 公開(公告)號: | CN104313068B | 公開(公告)日: | 2017-08-25 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人: | 黃和;任路靜;趙曉艷;莊小燕;紀(jì)曉俊 | 申請(專利權(quán))人: | 江蘇天凱生物科技有限公司 |
| 主分類號: | C12P9/00 | 分類號: | C12P9/00;C12R1/645 |
| 代理公司: | 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32204 | 代理人: | 肖明芳 |
| 地址: | 211800 江*** | 國省代碼: | 江蘇;32 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 磷脂 dha 發(fā)酵 制備 方法 | ||
1.一種磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法,其特征在于,它包括以下步驟:
(1)以產(chǎn)DHA的菌株為出發(fā)菌株,在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵,獲得富含甘油脂型DHA的菌體細(xì)胞;
(2)向步驟(1)高密度發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液中添加營養(yǎng)物質(zhì),繼續(xù)發(fā)酵獲得富含磷脂型DHA的菌體細(xì)胞;
(3)收集步驟(2)得到的富含磷脂型DHA的菌體細(xì)胞,經(jīng)破碎、萃取獲得富含磷脂型DHA的油脂;
其中,所述的營養(yǎng)物質(zhì)為碳源、氮源、磷源、氨基酸的任意一種或幾種的組合;
所述的碳源為乙醇、乙酸鈉中的任意一種或幾種的混合物,碳源的添加量為2~4g/L;
所述的氮源為硫酸銨、谷氨酸鈉中的任意一種或幾種的混合物,氮源的添加量為5~20g/L;
所述的磷源為磷酸二氫鉀,磷源的添加量為2~4g/L;
所述的氨基酸為脯氨酸或賴氨酸,添加量為0.1~0.5g/L;
所述的產(chǎn)DHA的菌株為CCTCC No:M209059;
步驟(1)中,所述的高密度發(fā)酵包括如下步驟:
(1a)將保存在甘油管中的菌株接入裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中,在20~30℃的搖床中,以150~200rpm的轉(zhuǎn)速,培養(yǎng)24~48h,獲得一級種子液;
(1b)將步驟(1a)得到的一級種子液按照2~10%v/v接種量接入裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中,在20~30℃的搖床中,以150~200rpm的轉(zhuǎn)速,培養(yǎng)24~48h,獲得二級種子液;
(1c)將步驟(1b)得到的二級種子液按照2~10%v/v接種量接入裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中,在20~30℃的搖床中,以150~200rpm的轉(zhuǎn)速,培養(yǎng)24~48h,獲得三級種子液;
(1d)將步驟(1c)中得到的三級種子液按照2~10%v/v接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,然后向發(fā)酵罐中加入消泡劑,在通氣量為0.2~1vvm、攪拌速度為100~200rpm、罐溫為20~30℃的條件下培養(yǎng)90~150h,使菌株發(fā)酵產(chǎn)富含甘油酯型DHA的油脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法,其特征在于,所述的種子培養(yǎng)基的碳含量為10~30g/L,所述的發(fā)酵培養(yǎng)基碳含量為20~60g/L,氮含量為2.1~2.5g/L,硫含量為2~3g/L,磷含量為0.4~1.5g/L;上述培養(yǎng)基中,碳源為葡萄糖、果糖或甘油;氮源為酵母膏、玉米漿、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨或硫酸銨;磷源為磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀,硫源為硫酸鎂或硫酸銨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法,其特征在于,步驟(1d)中,所述的消泡劑為silicone SE-2,添加量為0.3g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法,其特征在于,步驟(2)中,所述的繼續(xù)發(fā)酵條件為:通氣量0.5~1vvm,攪拌速度100~200rpm,罐溫20~30℃,繼續(xù)培養(yǎng)48~72h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法,其特征在于,步驟(3)具體過程為:收集菌體細(xì)胞,采用破壁酶破碎細(xì)胞,再用有機(jī)溶劑萃提4~8h,得到富含磷脂型DHA的油脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法,其特征在于,所述的有機(jī)溶劑為正己烷、石油醚、乙醇和乙醚中的任意一種或幾種的混合物,按照有機(jī)溶劑與破碎細(xì)胞液體積比1:0.5~2的量添加。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法,其特征在于,所述的破壁酶為蛋白酶,添加量為2~8g/L。
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