技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種自體樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞的制備方法，其中包括如下特征：來自于癌癥患者手術(shù)后新鮮自體腫瘤組織分離得到的浸潤性T淋巴細(xì)胞，在自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞和白介素2作用下激活大量擴增，具有高活性抗腫瘤細(xì)胞毒性應(yīng)答；本發(fā)明還提供了一種含通過上述方法而得到的自體腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞的試劑盒，可用于各類癌癥包括實體瘤和血液腫瘤在內(nèi)的免疫治療。

背景技術(shù)

腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞(Tumor-infiltrating?lymphocytes，TIL)在體外加白介素2(interleukin-2，IL-2)培養(yǎng)擴增后，其抗腫瘤作用比LAK細(xì)胞強50-100倍，而且只需要小量的IL-2就可以發(fā)揮作用，并且因其對自身腫瘤靶細(xì)胞具有特異性，成為國內(nèi)外腫瘤生物研究的熱點，并在臨床治療中得到使用。

TIL細(xì)胞主要含有CD8⁺、CD4⁺T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等，治療對黑素瘤、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等腫瘤治療有明顯療效。TIL細(xì)胞數(shù)量和殺傷功能與療效直接相關(guān)，治療中存在的問題在于獲得大量TIL細(xì)胞有限和培養(yǎng)時間過長。TIL細(xì)胞體外擴增至5×10⁸平均需59天，擴增至5×10⁹則平均需80天，TIL在含IL-2的培養(yǎng)基中經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后出現(xiàn)選擇性擴增T淋巴細(xì)胞，CD3⁺占80％以上，CD4⁺和CD8⁺占50％以上，NK細(xì)胞擴增低下，占不到10％左右。因而傳統(tǒng)使用的小劑量白介素2激活生長倍數(shù)有限，培養(yǎng)時間過長引起了TIL細(xì)胞殺傷功能低下。

本發(fā)明提供了以自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，在小劑量IL-2作用下大量擴增TIL細(xì)胞，培養(yǎng)至20天細(xì)胞增殖到5×10⁸以上，增殖倍數(shù)達(dá)到1000倍以上，TIL細(xì)胞殺瘤活性在20天達(dá)到最佳，為患者臨床治療大大節(jié)約了時間，并發(fā)揮出最好的抗腫瘤作用，有助于提高臨床療效和延長患者生存期，而且可以大大降低細(xì)胞培養(yǎng)成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)增殖培養(yǎng)TIL細(xì)胞的不足，特別是因TIL細(xì)胞擴增到臨床治療需要的細(xì)胞數(shù)量而培養(yǎng)時間過長，含IL-2的培養(yǎng)基選擇性擴增T淋巴細(xì)胞占有比例很低，因而產(chǎn)生的殺瘤活性低下。本發(fā)明通過前期研究實驗發(fā)現(xiàn)自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，作為滋養(yǎng)層細(xì)胞和低劑量IL-2作用下培養(yǎng)TIL細(xì)胞，培養(yǎng)至20天細(xì)胞增殖倍數(shù)達(dá)到1000倍以上，TIL細(xì)胞數(shù)達(dá)到5×10⁸以上足以滿足臨床抗腫瘤的作用，保證癌癥患者臨床治療療效。

自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞膜上高表達(dá)的CD80、CD83、CD86和CD137L多肽，及其加工的腫瘤抗原表位，將可以激活T淋巴細(xì)胞大量擴增和具有高活性的抗腫瘤細(xì)胞毒性應(yīng)答。將該樹突狀細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，可產(chǎn)生對腫瘤細(xì)胞最佳的殺傷活性。

本發(fā)明涉及一種自體樹突狀細(xì)胞激活腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞增殖的制備方法，其特征在于，使用自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞和白介素2，擴增激活腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞，使腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞得以大量增殖。

本發(fā)明所述的自體腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞，通過強酸，強堿和/或輻照、及通過高速離心收集樹突狀細(xì)胞，作為TIL激活擴增的滋養(yǎng)層細(xì)胞。

本發(fā)明所述方法中腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞來源于癌癥患者手術(shù)后新鮮自體腫瘤組織。

新鮮自體腫瘤組織使用眼科剪剪碎成1mm³的小塊，所得剪碎的組織小塊用0.25％(質(zhì)量體積比)胰酶或100活性單位/mL?I型膠原酶溶液以1克：0.5mL的重量體積比消化30分鐘后，加入消化液溶液體積1/5的小牛血清終止，消化液過10μM細(xì)胞篩，并用5mL1×PBS(pH＝7.4)洗滌兩次，過濾后的溶液以1000rpm離心收集細(xì)胞沉淀，加入AIM-V培養(yǎng)基重懸至10ml，單細(xì)胞懸液經(jīng)連續(xù)密度梯度離心分離得到腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞和自體腫瘤細(xì)胞。

腫瘤細(xì)胞用AIM-V培養(yǎng)基液稀釋成細(xì)胞濃度為2×10⁶/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，嚴(yán)密封口，用液氮行快速冷凍，室溫慢融，反復(fù)凍融3-5次，5000rpm離心10分鐘后取上清，加入到1.5mL離心管中制備成自體腫瘤抗原，于-80℃儲存，用于負(fù)載樹突狀細(xì)胞。