技術領域

本發明涉及酶聯免疫檢測技術領域，特別是檢測磺胺多殘留的酶聯免疫試劑盒。

背景技術

磺胺多殘留類藥物是一類具有廣譜抗菌活性的化學藥物，具有廉價、使用方便的特點，廣泛應用于獸醫臨床及動物飼料添加劑等領域。磺胺類藥物經過各種給藥途徑進入動物體內后，可轉移到肉、蛋和乳等動物性食品中，如果使用不合理很容易在動物組織中造成磺胺類藥物殘留。

人類經常食用有磺胺類藥物殘留的動物性食品，就可能引起磺胺類藥物在體內的逐漸蓄積，其危害性主要表現為變態反應與過敏反應、細菌耐藥性、致畸作用、致突變作用、致癌作用以及激素樣作用。同時，磺胺類藥物殘留也是目前動物性產品貿易的主要技術問題，嚴重影響了畜牧業的正常發展。因此，為了保障動物用藥的安全性和有效性，以及人類攝食動物性食品后的安全性，許多國家規定了磺胺類藥物殘留的最高殘留量（MRL）。加拿大、歐盟、美國規定動物組織中的磺胺類藥物總量的最大殘留量是100ug/Kg,日本為20ug/Kg。根據我國農業部1998年制定的“獸藥及其它化學物質在動物可食性動物組織中的允許殘留量標準為100ug/Kg-300ug/Kg。

目前，磺胺多殘留類的測定方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層層析法、高效液相色譜-質譜聯用法等，其檢測結果準確可靠，但儀器設備比較昂貴，且樣本前處理過程相對復雜。酶聯免疫吸附法是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應用于食品安全檢測行業。本發明旨在建立一種檢測磺胺多殘留的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。

發明內容

為了克服色譜法的不足，本發明提供一種檢測磺胺多殘留類的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。

發明內容

本發明檢測磺胺多殘留類的酶聯免疫試劑盒，包括酶標板、磺胺多殘留類標準品、磺胺多殘留類抗體工作液、磺胺多殘留類酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。

本發明檢測磺胺多殘留類的酶聯免疫試劑盒的制備，包括以下步驟：酶標板的制備、磺胺多殘留類標準品的制備、磺胺多殘留類抗體工作液的制備、磺胺多殘留類酶標二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。

其進一步特征在于：所述的酶標板經由磺胺多殘留類抗原包被制備，具體步驟是將磺胺多殘留類半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯得到包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將磺胺多殘留類包被抗原稀釋成1：100000比例，100μL/孔，37℃避光孵育2h，取出酶標板甩掉板內液體，加入經稀釋的濃縮洗滌液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150μL/孔，37℃放置1.5h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標板真空密封于4℃條件下保存。

磺胺多殘留類標準品濃度分別為0ng/mL、0.5ng/mL、1.5ng/mL、4.5ng/mL、13.5ng/mL、40.5ng/mL。

所述磺胺多殘留類抗體工作液是采用磺胺多殘留類人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：30000比例制備。

所述磺胺多殘留類酶標二抗工作液由酶標二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，所述底物液A為含有0.5mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5%吐溫-20，0.1mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。

檢測磺胺多殘留類的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法，基于抗原抗體的間接競爭酶聯免疫反應原理，該方法包括以下步驟：

(1)預處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液中；

(2)將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；