技術領域

本發明屬于生物催化領域，具體涉及高活力磷脂酶A₂和高活力磷脂酶D催化制備sn-2位為二十二碳六烯酸的磷脂酰絲氨酸(2-DHA-PS)的方法。

背景技術

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic?acid,DHA)是一種多不飽和脂肪酸，DHA碳鏈結構含有六個雙鍵，具有高度的不飽和性。DHA在人體自身難以合成，需由食物提供，是人體必需脂肪酸之一。DHA與人體的生理功能密切相關，可維持大腦、視網膜等的正常功能和生長發育，具有抑制血小板凝聚、抗血栓、調血脂、提高免疫力、健腦益智等功效，對抑制炎癥和部分癌癥、糖尿病的發生也有較好的功效。

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)是一種天然的磷脂，PS的結構決定了其具有雙親性的獨特性質，帶有負電荷的一端具有親水性(或水溶性)，由脂肪酸組成的另一端具有親脂性(或脂溶性)。PS能夠提高腦細胞活力，對預防老年癡呆癥、治療腦萎縮、改善老年人的大腦功能有很好的療效，此外對減少壓力激素的分泌、促進腦疲勞的恢復、平衡情緒、緩解抑郁癥也有一定的療效。PS還可以改善青少年學生的記憶力、增加學習時的集中力、有效提高學習成績、治療兒童多動癥。

單純地服用DHA會造成胃腸的負擔，而且DHA不容易通過血腦屏障。研究表明，PS可以作為DHA的一種載體，當DHA結合到磷脂酰絲氨酸甘油骨架2位時，DHA的穩定性更高，而且更易通過血腦屏障。DHA和PS在體外以2-DHA-PS的形式被吸收后，在大腦中最終轉化為DHA-PS而進行神經保護作用，2-DHA-PS可以兼具DHA和PS的生物學功能。

目前2-DHA-PS的生產方法主要是以富含不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿和絲氨酸為底物，在磷脂酶D的催化下合成富含不飽和脂肪酸的PS，但這種方法存在選擇性不高、易引入其他雜質、無法獲取高純度2-DHA-PS等問題。

磷脂酶D(EC3.1.4.4)，屬于催化磷酸二脂酯鍵水解和堿基交換反應的一類酶的總稱，分布在從細菌到高等動植物的眾多生物類群中，其主要生理功能是參與細胞脂質代謝，信號轉導及生物膜形成等。磷脂酶D的研究已開展了近五十年，但距工業生產的需要，特別是與其他酶生產和應用相比，存在很大的差距，究其原因，主要原因是，1.酶源狹窄且在生物體內含量極微，提純相當困難；2.該酶在生物體內的功能及作用機理尚未完全搞清，其應用范圍不廣。

磷脂酶A₂(EC3.1.1.4)，屬于催化磷脂甘油骨架2位(sn-2位)磷酸二脂酯鍵水解的一類酶的總稱，但是某些來源的磷脂酶A₂具有催化磷脂甘油骨架2位磷酸二脂酯鍵堿基交換的功能，其廣泛存在于哺乳動物的細胞和體液以及蛇毒、蜂毒、微生物中，是一種重要的代謝和調節酶類。磷脂酶A₂有很高的應用價值，但目前對其應用技術的研究還比較少，主要原因是，1.酶源狹窄，目前磷脂酶A2主要從動物胰臟、蛇毒、蜂毒中提取，也有從動物內臟或微生物中提取磷脂酶A2，但是工藝復雜，不利于磷脂酶A₂的大量生產和利用；2.該酶的作用機理尚未完全搞清，目前對其催化磷脂甘油骨架2位磷酸二脂酯鍵水解的研究較多，而對催化磷脂甘油骨架2位磷酸二脂酯鍵堿基交換的研究甚少。

枯草芽孢桿屬于革蘭氏陽性菌。枯草芽孢桿菌表達系統有以下優點：1、能夠高效地分泌各種蛋白質；2、許多枯草芽孢桿菌在發酵工業上的使用已有相當長的歷史，無致病性，不產生任何內毒素；3、芽孢桿菌屬微生物遺傳學背景研究的十分清楚，并具有生長迅速，對營養無特殊要求的優點；4密碼子偏愛性不明顯；5發酵簡單，枯草芽孢桿菌是好氧菌，無需厭氧發酵設備，對培養基無特殊要求，發酵結束后，簡單地分離發酵液和細菌菌體，即可進入目的蛋白的純化回收階段；6具有抗逆性，可生產多種耐熱性酶制劑。

畢赤酵母是一種單細胞低等真核生物，培養條件普通，生長繁殖速度迅速。畢赤酵母表達系統用于表達基因工程產品時，可以大規模生產，有效降低了生產成本。畢赤酵母表達系統具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質較原核表達系統表達的蛋白質更加穩定，畢赤酵母表達系統具有兩種表達形式，包括畢赤酵母游離表達系統和畢赤酵母細胞表面展示系統。畢赤酵母表達系統已成為現代分子生物學研究最重要的工具和模型，是表達外源基因比較理想的工具。