[發(fā)明專利]sn-2位為二十二碳六烯酸的磷脂酰絲氨酸的制備方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201410279967.8 | 申請(qǐng)日: | 2014-06-20 |
| 公開(公告)號(hào): | CN104004797A | 公開(公告)日: | 2014-08-27 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 路福平;劉逸寒;張濤;劉曉光;王正祥;王春霞;王建玲 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 天津科技大學(xué) |
| 主分類號(hào): | C12P13/04 | 分類號(hào): | C12P13/04;C12N9/16;C12N15/75;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12R1/125;C12R1/84 |
| 代理公司: | 北京鼎佳達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348 | 代理人: | 王偉鋒 |
| 地址: | 300457 天津市濱海新*** | 國(guó)省代碼: | 天津;12 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | sn 十二 碳六烯酸 磷脂 絲氨酸 制備 方法 | ||
1.一種2-DHA-PS的制備方法,其特征在于,所述方法包括:絲氨酸與磷脂酰膽堿在高活力磷脂酶D的催化下生成磷脂酰絲氨酸,磷脂酰絲氨酸與DHA在高活力磷脂酶A2的催化下生成2-DHA-PS;所述高活力磷脂酶A2含有如SEQ?ID?NO:10所示的氨基酸序列,是氨基酸序列如SEQ?ID?NO:9所示的野生型磷脂酶A2通過(guò)定點(diǎn)突變得到的突變體;所述高活力磷脂酶D來(lái)源于專利CN102286440B。
2.如權(quán)利要求1所述的2-DHA-PS的制備方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:
(1)將所述高活力磷脂酶D加入pH3.0-6.0的含有絲氨酸、CaCl2的醋酸-醋酸鈉緩沖液中,與含有磷脂酰膽堿的乙醚等體積混合均勻,在30-50℃下反應(yīng)6-16小時(shí);其中,反應(yīng)之前高活力磷脂酶D濃度為1.0-4.0U/mL、絲氨酸的濃度為1.0-3.0M、CaCl2的濃度為2.0mM;
(2)反應(yīng)結(jié)束后靜置分層,提取含磷酯酰絲氨酸的有機(jī)相;
(3)在步驟(2)得到的含磷酯酰絲氨酸的有機(jī)相中加入二十二碳六烯酸,然后與pH4.0-9.0的含有高活力磷脂酶A2、CaCl2的磷酸鹽緩沖液等體積混合均勻,在30-50℃下反應(yīng)6-16小時(shí);其中,反應(yīng)之前磷脂酶A2濃度為10-40U/mL、CaCl2的濃度為2.0mM;
(4)反應(yīng)結(jié)束后靜置分層,提取有機(jī)相并加入4-6倍體積的丙酮將生成的2-DHA-PS沉淀下來(lái),然后離心分離,收集沉淀并用丙酮洗滌2-4次,即可得到2-DHA-PS產(chǎn)品。
3.如權(quán)利要求2所述的2-DHA-PS的制備方法,其特征在于,步驟(1)中所述磷脂酰膽堿的濃度為0.05-0.3M。
4.如權(quán)利要求2所述的2-DHA-PS的制備方法,其特征在于,步驟(3)中所述二十二碳六烯酸的濃度為0.1-0.4M。
5.如權(quán)利要求1-4任一一項(xiàng)所述的2-DHA-PS的制備方法,其特征在于,以氨基酸序列如SEQ?ID?NO:9所示的野生型磷脂酶A2代替所述高活力磷脂酶A2。
6.如權(quán)利要求1-4任一一項(xiàng)所述的2-DHA-PS的制備方法,其特征在于,所述高活力磷脂酶A2由枯草芽孢桿菌高活力磷脂酶A2重組菌株、畢赤酵母高活力磷脂酶A2游離表達(dá)重組菌株或畢赤酵母細(xì)胞表面展示高活力磷脂酶A2重組菌株制備。
7.如權(quán)利要求6所述的2-DHA-PS的制備方法,其特征在于,由枯草芽孢桿菌高活力磷脂酶A2重組菌株制備所述高活力磷脂酶A2包括以下步驟:
(1)將野生型磷脂酶A2基因與載體pUC-T連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-T-plA2,通過(guò)重疊PCR定點(diǎn)突變野生型磷脂酶A2基因,得到如SEQ?ID?NO:8所示高活力磷脂酶A2突變體編碼基因;
(2)將高活力磷脂酶A2突變體編碼基因與大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pBSA43連接,構(gòu)建獲得攜帶有高活力磷脂酶A2突變體編碼基因的重組載體;
(3)將重組載體轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌WB600中,構(gòu)建獲得重組菌株;
(4)將重組細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵制備并提取高活力磷脂酶A2;
(5)提取高活力磷脂酶A2。
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