技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種噬菌體免疫環介導等溫擴增檢測法，利用噬菌體展示多肽，將免疫競爭和環介導等溫擴增結合，實現對不含有核酸的小分子化合物的環介導等溫擴增檢測。

背景技術

有機磷農藥(Organophosphorus?pesticide，簡稱OP)是一類廣泛用于防治病蟲害的農藥。由于其具有高毒性，所以在使用過程中也會使一些非靶標生物受到毒害。同時，隨著人們對食品和環境安全的關注，建立一種高通量、靈敏的檢測方法對有機磷農藥殘留的防控有著重要的意義。

環介導等溫擴增(loop-mediated?Isothermal?Amplification，LAMP)是2000年由日本科學家Notomi，T.首次在Nucleic?Acids?Research雜志上報道的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。環介導等溫擴增技術的特點是針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一條鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63℃左右)保溫30-60分鐘，即可完成核酸擴增反應。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程，只需要恒溫環境。不僅大大降低了檢測的費用，而且給檢測帶來極大方便。由于農藥是不含核酸序列的小分子化合物，所以該方法在農藥等小分子化合物中的應用被忽略。

噬菌體展示技術是1985年由Smith，G.P.首次在Science雜志上報道，已經作為一種強大的工具運用在不同的研究中，包括篩選抗體和酶的配體；篩選小分子的受體；抗體工程等。其原理是將多肽或蛋白質的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，以利于靶分子的識別和結合。當噬菌體展示的多肽為隨機序列時為噬菌體展示多肽庫，利用抗體對噬菌體展示多肽庫進行親和淘選，可篩選出能夠和抗體結合的噬菌體展示多肽。由于篩選出的多肽連接在噬菌體外殼蛋白上，并且噬菌體自身含有核酸，所以篩選出的多肽不需要與核酸模板連接，可直接被LAMP檢測。利用噬菌體展示多肽的特點，建立有機磷農藥免疫LAMP檢測方法。該發明為食品安全檢測、農產品等的出入境檢測、環境監測部門的監測提供有效的技術手段和檢測方法。對我國農產品的可持續發展和食品安全問題具有重要的現實意義和重要的社會、經濟價值。目前國內外尚未見有關免疫LAMP方法在農藥等其他小分子化合物上的應用報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新穎、快速、靈敏和實用的噬菌體免疫環介導等溫擴增檢測法，利用噬菌體展示多肽，將免疫競爭和環介導等溫擴增結合，以實現對不含有核酸的小分子化合物的環介導等溫擴增檢測。

本發明提供的噬菌體免疫環介導等溫擴增檢測法，包括：

第一步：噬菌體展示多肽與分析物共同競爭捕獲抗體的結合位點，

包被：用PBS緩沖液將抗體稀釋為10μg/mL后加入酶標板，每孔100μL，37℃孵育2小時；洗板：用洗滌液PBST(0.05％吐溫20，0.01mol/L，pH7.4)洗滌5次，吸水紙拍干；封閉：每孔加入300μL1％BSA，37℃孵育1小時；洗板：用洗滌液PBST(0.05％吐溫20，0.01mol/L，pH7.4)洗滌5次，吸水紙拍干；加入分析物和噬菌體：每孔加入50μL分析物，再加入50μL的噬菌體，37℃孵育1小時；洗板：用洗滌液PBST(0.05％吐溫20，0.01mol/L，pH7.4)洗滌5次，吸水紙拍干；洗脫：每孔加入100μL?0.2M?pH2.2甘氨酸鹽酸緩沖液37℃洗脫15分鐘，洗脫后收集洗脫液并用1M?pH9.1?Tris-HCl進行中和。

第二步：環介導等溫擴增結合在捕獲抗體上的噬菌體，

以FIP、BIP為內引物，以F3、B3為外引物對洗脫的噬菌體進行恒溫擴增。其反應體系為：0.64M?betaine，1mM?dNTPs，2.5μL?10×Bst?Buffer，8U?Bst?DNA聚合酶，150μM羥基萘酚藍(hydroxynaphthol?blue，HNB)，2μL中和后的噬菌體洗脫液，外引物各0.2μM，內引物各1.2μM，ddH₂O補齊至25μL。將上述所有試劑混勻置于PCR管中，63℃?60min，80℃?10min終止反應。

第三步：免疫環介導等溫擴增反應產物分析及結果判定，