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[發明專利]噬菌體免疫環介導等溫擴增檢測法有效

專利信息
申請號: 201410272493.4 申請日: 2014-06-17
公開(公告)號: CN104046702A 公開(公告)日: 2014-09-17
發明(設計)人: 華修德;王鳴華;劉鳳權;施海燕 申請(專利權)人: 南京農業大學
主分類號: C12Q1/70 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/92
代理公司: 暫無信息 代理人: 暫無信息
地址: 210095 江蘇省南*** 國省代碼: 江蘇;32
權利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關鍵詞: 噬菌體 免疫 環介導 等溫 擴增 檢測
【權利要求書】:

1.一種噬菌體免疫環介導等溫擴增檢測法,其特征包括:

第一步:噬菌體展示多肽與分析物共同競爭捕獲抗體的結合位點,

包被:用PBS緩沖液將抗體稀釋為10μg/mL后加入酶標板,每孔100μL,37℃孵育2小時;洗板:用洗滌液PBST(0.05%吐溫20,0.01mol/L,pH7.4)洗滌5次,吸水紙拍干;封閉:每孔加入300μL1%BSA,37℃孵育1小時;洗板:用洗滌液PBST(0.05%吐溫20,0.01mol/L,pH7.4)洗滌5次,吸水紙拍干;加入分析物和噬菌體:每孔加入50μL分析物,再加入50μL的噬菌體,37℃孵育1小時;洗板:用洗滌液PBST(0.05%吐溫20,0.01mol/L,pH7.4)洗滌5次,吸水紙拍干;洗脫:每孔加入100μL0.2M?pH2.2甘氨酸鹽酸緩沖液37℃洗脫15分鐘,洗脫后收集洗脫液并用1M?pH9.1Tris-HCl進行中和。

第二步:環介導等溫擴增結合在捕獲抗體上的噬菌體,

以FIP、BIP為內引物,以F3、B3為外引物對洗脫的噬菌體進行恒溫擴增。其反應體系為:0.64M?betaine,1mM?dNTPs,2.5μL?10×Bst?Buffer,8U?Bst?DNA聚合酶,150μM羥基萘酚藍(hydroxynaphthol?blue,HNB),2μL中和后的噬菌體洗脫液,外引物各0.2μM,內引物各1.2μM,ddH2O補齊至25μL。將上述所有試劑混勻置于PCR管中,63℃?60min,80℃?10min終止反應。

第三步:免疫環介導等溫擴增反應產物分析及結果判定,

分析方法1:瓊脂糖凝膠電泳:取3μL擴增產物,加入1μL上樣緩沖液(購自TAKARA公司),混勻,在2%(W/V)瓊脂糖凝膠中101V下電泳1小時,用溴化乙錠(EB)染色15min后,在凝膠成像系統上成像;

分析方法2:在日光下用肉眼觀察結果。

結果判定:在分析方法1中,在凝膠成像系統的紫外燈下觀察是否有梯形條帶,若有條帶為陰性,若無條帶為陽性。在分析方法2中,若擴增產物的顏色變為天藍色則為陰性,若保持深藍色不變為陽性。

2.根據權利要求1所述的噬菌體免疫環介導等溫擴增檢測法,其特征在于利用噬菌體展示多肽,將免疫競爭和環介導等溫擴增結合,實現對不含有核酸的小分子化合物的環介導等溫擴增檢測。

3.根據權利要求1和2所述的噬菌體展示多肽為展示在M13噬菌體外殼蛋白上的小分子模擬表為多肽。

4.權利要求1所述的環介導等溫擴增引物是根據M13噬菌體ssDNA特異性序列設計。

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