技術領域

本發明涉及一種TALEN-R11蛋白，具體涉及一種穿膜型的帶有熒光標簽的TALEN-R11蛋白，本發明還涉及該TALEN-R11蛋白的制備方法和應用；屬于生物技術領域，

背景技術

細胞穿透肽多數為長度小于30個氨基酸的多肽分子，已經發現其可以攜帶多種物質，包括親水性蛋白、多肽、DNA甚至顆粒性物質等進行細胞間或細胞內的運輸，且不受細胞類型的限制，在細胞生物學、基因治療學以及藥學等領域具有很大的研究價值。

基因定點修飾是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人類遺傳性疾病的治療和藥物靶點篩選，因此這類技術成為現代分子生物學的研究熱點。

近年來興起的類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription?activator-like?effector?nuclease,TALEN)技術是一種嶄新的分子生物學工具。科學家發現，來自植物細菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關系。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內源性基因的目的。目前TALE技術主要應用是用TALEN技術構建針對任意特定核酸靶序列的重組核酸酶，在特異的位點打斷目標基因DNA，進而在該位點進行DNA操作，如Knock-out。它克服了常規的ZFN方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經常受上下游序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的活性，使基因操作變得更加簡單、方便。

目前，利用shRNA庫做藥物靶點篩選已經很普遍。而且其只限于質粒或者修飾后的核苷酸的形式來轉染細胞。其效率比低，脫靶效應嚴重。

發明內容

針對上述問題，本發明的提供一種可以特異性敲除細胞內源基因，達到基因治療的目的穿膜型的帶有熒光標簽的TALEN-R11蛋白，本發明還提供該TALEN-R11蛋白的制備方法以及敲除細胞內源基因的方法。

為解決前一技術問題，本發明提供的第一個技術方案是這樣的：該穿膜型的帶有熒光標簽的TALEN-R11蛋白，其所述的TALEN蛋白的L鏈和R鏈的N端分別帶有熒光蛋白EGFP和DesRed，TALEN蛋白的L鏈和R鏈的C端分別帶有穿膜肽R11，即為EGFP-TALEN-R11和DesRed-TALEN-R11的蛋白。

上述的穿膜型的帶有熒光標簽的TALEN-R11蛋白，所述的EGFP-TALEN-R11的堿基編碼如SEQ?ID?NO.1所示。

上述的穿膜型的帶有熒光標簽的TALEN-R11蛋白，所述的EGFP-TALEN-R11的堿基編碼如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明提供的另外一技術方案是這樣的：該穿膜型的帶有熒光標簽的TALEN-R11蛋白的制備方法，依次包括下述方法：

1)載體的構建

a)EGFP-TALEN-R11原核表達載體的構建：

用核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示的引物TALE-GFP_F：NdeI58和核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示的引物GFP_R，擴展質粒pTALEN_v2的EGFP蛋白，回收PCR片段；然后用核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示的引物GFP_F，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的引物TALE_R2：BamHI擴展TALE-ccdB-Chl片段；兩個片段融合后，克隆到原核表達載體PET-16b的NdeI和BamHI位點，得pET16b-EGFP-TALEN-R11原核表達載體；

b)DesRed-TALEN-R11原核表達載體的構建：

用核苷酸序列如SEQ?ID?NO.8所示的引物TALE-DesRed_F：NdeI58和核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9所示的引物DesRed_R擴展粒pTALEN_v2的DesRed蛋白，回收PCR片段，然后用核苷酸序列如SEQ?ID?NO.10所示的引物DesRed_F，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示的引物TALE_R1，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的引物TALE_R2：BamHI去擴展TALE-ccdB-Chl片段，回收PCR片段；