技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測淋巴細胞增殖的方法。

背景技術

淋巴細胞增殖和分化是機體免疫應答過程的一個重要階段，因此，檢測淋巴細胞增殖水平是細胞免疫研究和臨床免疫功能檢測的一種常用方法，是各醫學專業學生,?特別是檢驗專業學生必做的實驗項目。臨床上主要用于檢測各種藥物對免疫功能的影響以及用于腫瘤、遲發性變態反應、細胞免疫缺陷等可能有細胞免疫參與的疾病診斷。

淋巴細胞的增殖活化過程會發生許多復雜的生化反應，這些反應包括與膜相關聯的早期現象，例如磷脂合成的增加、二價陽離子通透性增加、腺嘌呤環化酶的活化作用和胞內cAMP的同時增加；緊隨之后的是膜表面CD分子的改變、細胞內RNA及DNA合成的增加，最終導致淋巴細胞形態學發生特征性改變和增值分裂，這些生化反應是淋巴細胞增殖實驗的基本原理。目前淋巴細胞增殖檢測的方法很多，常用的有：基于淋巴細胞增殖反應過程中DNA合成增加特點，通過氚標記的胸苷（3H-dT）摻入率來測定淋巴細胞的增殖水平。根據淋巴細胞轉化為淋巴母細胞的形態學改變特點而提出的淋巴細胞轉化試驗，通過檢測淋巴細胞的轉化率來測定淋巴細胞的增殖水平。隨著分子生物學的發展，越來越多的分子指標作為淋巴細胞增殖的標識，例如把多種淋巴細胞膜表面CD分子作為淋巴細胞增殖的標志物，通過流式細胞儀來檢測淋巴細胞膜表面CD分子表達變化情況來測定淋巴細胞的增殖水平。

目前DNA合成最準確的檢測方法是使用氚標記的胸苷（3H-dT）,在DNA合成過程中3H-dT其摻入量可由液相閃爍儀來檢測，通過該摻入量來計算DNA合成能力并間接反映淋巴細胞的增殖水平。由于使用了放射性物質，此方法對實驗室要求很高，并且可能會對環境和工作場所造成放射性污染。同時，此方法是通過放射性計數來反映細胞免疫功能的，實驗組和對照組的細胞數必須保證絕對相同，否則實驗結果就不具有可信性。這兩方面的缺點限制了此法的廣泛應用。

淋巴細胞轉化是通過對培養物中存在的淋巴母細胞百分比來評估的。轉化淋巴細胞即淋巴母細胞的形態特征是：(1)轉化淋巴母細胞體積增大，約大于原淋巴細胞3倍；(2)細胞核的核膜清晰，核內染色質疏松呈網狀結構，可見1～3個核仁，有的核呈分裂相；(3)胞漿豐富，呈嗜堿性染色，核周圍的胞漿有一染色較淺的透明區，為偽足狀突起，胞漿內有小空泡出現。該方法的主要優點是從形態學判斷轉化淋巴細胞，但因其極端變異性和結果的主觀性而得不到廣泛利用。

通過流式細胞儀來檢測淋巴細胞膜表面CD分子表達變化情況來測定淋巴細胞的增殖水平。該方法能夠檢測不同亞群細胞對多克隆或特異性刺激物的反應性，具有自動化程度高，高通量的優點，是當前最常見的淋巴細胞增殖檢測方法，但流式細胞儀和各種CD分子抗體價格昂貴。

由于上述常規方法本身的缺陷，實際應用中會碰到一系列的問題；另外，由于其復雜性和精確性，這些常規方法絕對不適用于臨床，只能限于實驗室研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡便、經濟、用途廣，且適合于臨床使用的檢測淋巴細胞增殖的方法。

依據原理：生理情況下靜止淋巴細胞暴露于促細胞分裂劑植物凝集素（PHA）可以轉化為淋巴母細胞并可進一步分裂增殖，淋巴細胞的增殖活化能力與機體的細胞免疫有關；而松胞素B可以阻滯細胞的分裂而不阻滯細胞核的分裂。具有不同增殖能力的淋巴細胞經過PHA和松胞素B的雙重作用后的雙核細胞率會不同，增殖能力越強的淋巴細胞的雙核細胞率越高。因此，可通過淋巴細胞的雙核率直觀地反映淋巴細胞的增殖水平。

本發明提供的檢測淋巴細胞增殖的方法，具體步驟如下：

1、取若干份健康人外周血，每份血分成照射組（即增殖抑制組）和非照射組；

2、血樣用含PHA營養液培養：無菌操作將0.2-0.6ml血樣加入含有PHA營養液小瓶內，PHA終濃度為30-70μg/ml，混勻后，置于溫箱中培養1-2天；

3、加入松胞素B繼續培養：在含PHA營養液中培養結束后，向培養液內加入松胞素B，終濃度為2-6μg/ml，溫箱中繼續培養24-36h；

4、溶解紅細胞：培養結束后，吸棄上清液，加入預溫的質量濃度為0.87%?NH₄Cl溶液3-5ml，置于溫箱中孵育10-15min；

5、低滲處理：離心棄上清后每管細胞加入5-10ml?0.075M?KCl混勻，室溫低滲10-20min；