技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法。

背景技術

硒蛋白是一組含有微量元素硒的特殊蛋白質，硒蛋白大都是以硒代半胱氨酸為活性中心、具有氧化還原酶特性的蛋白質，是微量元素硒在哺乳動物和人體內發揮生理功能的主要載體。這些蛋白質參與體內自由基清除，維持氧化-還原穩態，調節甲狀腺素合成，構成精子結構等。目前發現人體有25種硒蛋白基因，大鼠或小鼠體內有24種硒蛋白基因。硒蛋白基因轉錄時，可因不同剪接方式生成更多的mRNA(轉錄變異體)和蛋白質，個別基因有多個轉錄變異體(mRNA)。mRNA的多少反映著基因表達水平的高低。因此，分析硒蛋白基因組表達譜是研究硒生物學功能的重要內容之一，而大鼠是一種良好的動物模型。

檢測基因mRNA豐度的方法在早期有Northern?blot技術、核糖核酸酶保護實驗(Ribonuclease?Protection?Assay,RPA)和反轉錄PCR(reverse?transcription-PCR,RT-PCR)技術。以下將對3項技術作一介紹。

1.Northern?blot：該方法的原理是通過檢測與目的基因mRNA特異結合的核酸探針信號強度來推算目的基因mRNA豐度。主要步驟概括為：RNA提取-凝膠電泳分離-轉印-探針雜交-顯影，實驗流程為：

(1)從組織或細胞中提取總RNA(可選步驟：再經過寡聚(dT)純化柱進行分離純化得到mRNA)；

(2)RNA樣本經過變性電泳(用含有甲醛的瓊脂糖凝膠，減少RNA的二級結構)后按分子量大小而被分離，對小分子的RNA或者microRNA一般采用聚丙烯酰胺變性膠電泳，電泳完成后的膠可經過溴化乙錠(Ethidium?bromide,EB)染色后在紫外下檢測RNA的質量；

(3)用轉印設備將凝膠上帶負電荷的RNA轉移到帶有正電荷的硝酸纖維膜或PVDF膜上(轉膜的緩沖液含甲酰胺，降低RNA樣本與后續探針雜交的退火溫度，減少因高溫條件降解RNA的風險)；

(4)帶有RNA分子的膜經烘烤或紫外交聯加以固定；

(5)將帶有放射性或特殊發光物標記的探針與轉印膜雜交孵育；

(6)可采用X膠片顯色或熒光成像儀檢測探針信號強度，以確定目的基因mRNA的豐都水平。

Northern?blot的優勢在于它可檢測目的片段的大小、是否具有可變剪切出現、可允許探針的部分不配對性，雜交過后的膜經過一定的處理除去探針后還可保存很長時間再次雜交使用；但是，其同時存在以下不足：操作過程繁瑣、容易出現RNA降解、不太適合較多樣本的檢測。此外，該實驗中很多實驗用品如甲醛、EB、紫外燈等等對人體都有一定的傷害；Northern?blot還存在靈敏度不高的缺點。

2.RPA實驗：其原理類似于Northern?blot。方法是：將標記的特異RNA探針(32P或生物素)與待測的RNA樣品液相雜交，使RNA探針與目的基因mRNA發生特異性的堿基互補配對結合，形成雙鏈RNA；用RNA酶(A或T1)消化那些未與探針結合的單鏈RNA(即非目的基因RNA)形成寡核糖核酸，而待測目的基因與探針結合成的雙鏈RNA則免受RNA酶的消化；對放射性同位素³²P標記的探針，雜交雙鏈經變性聚丙酰胺凝膠電泳后，用放射自顯影或磷屏成像系統檢測被保護的探針的信號；而對生物素標記的探針，電泳后需類似Northern?blot一樣轉移至尼龍膜，再用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶和化學發光底物與膜上探針所帶的生物素結合，最后以X射線膠片或化學發光圖像分析儀檢測雜交信號。但是，RPA實驗具有上述Northern?blot實驗類似的缺點.