[發明專利]一種基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法有效
| 申請號: | 201410165791.3 | 申請日: | 2014-04-23 |
| 公開(公告)號: | CN103952484A | 公開(公告)日: | 2014-07-30 |
| 發明(設計)人: | 周繼昌;劉小立;朱玉梅;鄭世杰;龔春梅;莫俊鑾;許佳章 | 申請(專利權)人: | 深圳市慢性病防治中心 |
| 主分類號: | C12Q1/68 | 分類號: | C12Q1/68 |
| 代理公司: | 深圳中一專利商標事務所 44237 | 代理人: | 張全文 |
| 地址: | 518000 廣東*** | 國省代碼: | 廣東;44 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 基于 qpcr 分析 大鼠 蛋白 基因 表達 方法 | ||
1.一種基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法,包括以下步驟:
分別設計大鼠各硒蛋白基因以及內參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物,除不具內含子的基因外,其他所述各基因的qPCR引物中的至少一條為跨內含子基因的qPCR引物;
提取、純化大鼠總RNA,并以此為模板合成cDNA,得到qPCR模板;
將上述qPCR模板進行qPCR擴增,并對擴增產物進行qPCR分析,計算擴增效率。
2.如權利要求1所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法,其特征在于,所述大鼠各硒蛋白基因以及內參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物分別如SED?ID?NO:1至SED?ID?NO:56所示。
3.如權利要求1所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法,其特征在于,在所述設計大鼠各硒蛋白基因和內參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物的步驟中,所述跨內含子基因的qPCR引物的跨越部位位于引物3’端。
4.如權利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法,其特征在于,在所述設計大鼠各硒蛋白基因和內參基因Actb、Gapdh的mRNA的qPCR引物的步驟中,所述qPCR引物靠近各基因mRNA的3’端。
5.如權利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法,其特征在于,所述qPCR擴增產物長度為80~200bp。
6.如權利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法,其特征在于,所述qPCR引物的長度為18-27bp。
7.如權利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法,其特征在于,在所述純化大鼠總RNA的步驟中,采用加入DNase?I酶去除殘留在RNA中的DNA。
8.如權利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法,其特征在于,在所述提取、純化大鼠總RNA、并以此為模板合成cDNA的步驟中,還包括對提取的RNA進行純度測量處理,所述純度測量處理的要求為A260/A280的比值>1.9。
9.如權利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法,其特征在于,在所述將qPCR模板進行qPCR擴增的步驟中,PCR擴增反應體系為:
反應條件為:
第一階段預變性:92-95℃/3min;
第二階段:92-95℃/5-10s,55-60℃/15-20s,68-72℃/10-15s;
共40-45個循環。
10.如權利要求1~3任一所述的基于qPCR分析大鼠硒蛋白基因表達譜的方法,其特征在于,所述對擴增產物進行qPCR分析、計算擴增效率的方法為:將所述qPCR擴增產物用PCR產物純化試劑盒純化后做為標準品,以ddH2O稀釋約10000倍后,再以10倍為倍數進行稀釋,最終選取稀釋倍數為104-108之間的5個稀釋度進行qPCR檢測,以定量循環數值為縱坐標,稀釋倍數為橫坐標,做擴增效率標準曲線,計算擴增效率,其中,擴增效率計算公式為:E=10-1/斜率。
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