技術領域

本發明涉及人類免疫缺陷病毒（human?immunodeficiency?virus，HIV）的分析檢測技術，尤其涉及一種HIV抗體及HIV-1p24抗原雙標記時間分辨熒光免疫分析方法及試劑盒。

背景技術

人類免疫缺陷病毒（HIV）于1981年在美國首次發現，是一種感染人類免疫系統細胞的慢病毒（lentivirus），屬反轉錄病毒的一種。該病毒破壞人體的免疫能力，導致免疫系統的失去抵抗力，從而導致各種疾病及癌癥在人體中的發生，發展到最后，導致艾滋病（獲得性免疫缺陷綜合癥，acquired?immuno?deficiency?syndrome，AIDS）。

HIV病毒基因組是兩條相同的正鏈RNA，每條RNA長約9.2-9.8kb，編碼了至少9個蛋白，可分為3類：結構蛋白、調控蛋白、輔助蛋白。根據基因組序列和結構，將HIV分為HIV-1與HIV-2，核酸雜交法檢查HIV-1與HIV-2的核苷酸序列僅40%相同。目前已發現HIV-1的主要抗原為gag基因編碼水解形成的P24核蛋白以及env基因編碼的gp160、gp120；HIV-1O的主要抗原為env基因編碼的gp41，HIV-2的主要抗原為env基因編碼的gp36。

目前用于HIV檢測方法有檢測HIV感染者體液中病毒抗原和/或抗體的方法，操作方便，易于普及應用，其中抗體檢測尤普遍。但HIV-1p24抗原在HIV感染檢測中的地位和重要性也日益受到重視。HIV-1侵入機體后，核心抗原P24的水平隨著病毒RNA水平的發展而發展，并在急性感染期即可出現,通常被認為是病毒復制的間接標志，與病情發展密切相關。因此，血液及其它體液標本中P24抗原的檢測可以縮短窗口期，有助于HIV-1的早期診斷、預后判斷及評價抗病毒治療的效果,具有良好的實際應用價值。隨著P24抗原檢測技術的不斷進步，低成本的P24抗原檢測有望在一定程度上替代現有的昂貴的RNA?測定法。目前，最新一代（第四代）HIV檢測試劑采用的是HIV-1/HIV-2抗體與HIV-1O亞群抗體及HIV-1?p24抗原的聯合檢測方法，但該試劑只能用于定性檢測，難以實現精確定量，且不能區分HIV?抗體和抗原。

目前，HIV常用的檢測方法有放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA）、酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)、化學發光免疫分析法(chemiluminescent?immunoassay，CLIA)、電化學發光免疫分析法（electro-chemiluminescence?immunoassay，ECLI）等。RIA由于放射性污染，對環境和操作者影響較大，批內批間變異較大，難于自動化；ELISA采用大分子酶標記，且酶容易失活，這種依靠比色法或偏振光法的檢測技術所受的干擾因素太多(即使是優秀的“管式ELISA”，其試管形狀的變化也會影響試驗的結果)，其靈敏度、線性和穩定性未能高于RIA；CLIA的化學發光通常是瞬間完成，發光峰值很快衰減，溫度和pH值對發光有很大影響，該類因素影響了該類方法的應用；ECLI仍為非開放系統，試劑依賴進口，試劑昂貴，維修及檢測成本高，這也限制了其推廣應用。

時間分辨熒光免疫分析(time-resolved?fluoroimmunoassay，TRFIA)利用具有獨特熒光特性的鑭系元素，如銪(Eu)、鋱(Te)、釤(Sm)、鏑(Dy)?等及其螯合物為示蹤劑，代替酶、同位素、熒光物質、化學發光物質等標記抗體、抗原、源素、多肽、蛋白質、核酸探針及生物細胞，待反應體系完成后，用時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應物中的熒光強度，定量分析待測物質的含量。由于鑭系元素熒光時間極長，為傳統熒光的10³～10⁶?倍。激發光與發射光之間的stokes?位移大，可達290nm，而普通熒光素的stokes?位移僅28nm，采用波長分辨和時間延遲的方法，可大大提高檢測靈敏度和特異性，目前已應用于臨床微量物質，如乙型肝炎病毒標志物以及前列腺抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白等腫瘤標志物的定量測定。TRFIA克服了RIA放射性污染的不足、酶標記物的不穩定性和定量范圍窄的缺陷、化學發光僅能一次發光、一般熒光標記受環境干擾的難點和ECLI的非直接標記等缺點，Eu標記TRFIA的靈敏度可達10^-19?mol/L，目前已實現了分析技術的自動化。然而由于TRFIA法是剛剛開發出來的方法，可檢測項目不多，許多項目亟待研究開發；而且在研發過程中需解決本方法穩定性、可重復性的問題。

發明內容