[發明專利]HIV抗體及HIV-1p24抗原雙標記時間分辨熒光免疫分析方法及試劑盒無效
| 申請號: | 201410129830.4 | 申請日: | 2014-04-01 |
| 公開(公告)號: | CN103869073A | 公開(公告)日: | 2014-06-18 |
| 發明(設計)人: | 譚玉華;李奕輝;陳建起;范主橋 | 申請(專利權)人: | 廣州市豐華生物工程有限公司 |
| 主分類號: | G01N33/577 | 分類號: | G01N33/577;G01N33/571;G01N33/533 |
| 代理公司: | 廣州三環專利代理有限公司 44202 | 代理人: | 郝傳鑫 |
| 地址: | 510730 *** | 國省代碼: | 廣東;44 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | hiv 抗體 p24 抗原 標記 時間 分辨 熒光 免疫 分析 方法 試劑盒 | ||
1.一種HIV抗體及HIV-1p24抗原雙標記時間分辨熒光免疫分析方法,其特征在于,包括以下步驟:
①制備抗原和抗體固相載體:將HIV抗原和HIV-1p24單克隆抗體用包被緩沖液稀釋后作為包被液,包被固相載體,用封閉液封閉,形成抗原和抗體固相載體;
②制備生物素標記抗體:用常規方法對HIV-1p24單克隆抗體進行生物素標記,形成生物素標記抗體;
③制備鑭系元素1標記的HIV抗原:參照鑭系元素離子標記試劑盒說明書,用鑭系元素1對HIV抗原進行標記,制備鑭系元素1標記的HIV抗原;
④制備鑭系元素2標記的鏈霉親和素:參照鑭系元素離子標記試劑盒說明書,用鑭系元素2對鏈霉親和素進行標記,制備鑭系元素2標記的鏈霉親和素;其中,所述鑭系元素1和鑭系元素2是不同的鑭系元素;
⑤測定方法:在步驟①制得的抗原和抗體固相載體中,加入含有HIV標準抗體和HIV-1p24標準抗原的校準品或待測樣品,加入步驟②制備的生物素標記抗體,經孵育、洗滌所述固相載體后,加入步驟③制備的鑭系元素1標記的HIV抗原和步驟④制備鑭系元素2標記的鏈霉親和素,再次孵育、洗滌所述固相載體后,加入增強液進行熒光檢測;其中,所述HIV標準抗體中不含HIV-1p24抗體。
2.如權利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述步驟①中,具體制備步驟如下:將HIV抗原和HIV-1p24單克隆抗體用包被緩沖液分別稀釋至0.1~10μg/ml后作為包被液,包被固相載體,孵育、洗滌固相載體后,用封閉液進行封閉,晾干;其中,所述固相載體為微孔反應條或微孔反應板;所述包被緩沖液為pH9.6的50mmol/L碳酸鹽緩沖液、pH4.5的20mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH7.8的50mmol/L?Tris-HCl緩沖液或pH4.5的50mmol/L檸檬酸鹽緩沖液;所述封閉液為含0.5%BSA、pH7.8的50mmol/L?Tris-HCl緩沖液。
3.如權利要求1所述的分析法,其特征在于,所述步驟③中,具體制備步驟如下:將HIV抗原加入到截留分子量為10000的超濾離心管中,8000r/min離心5~6min,用pH8.0~9.8、50mmol/L碳酸鹽標記緩沖液重復洗滌后,將處理得到的HIV抗原加入到預先用標記緩沖液溶解的鑭系元素1標記試劑中,混勻,2~8℃振蕩孵育72±2h,反應液經用pH7.8、50mmol/LTris-HCl緩沖液平衡的層析柱層析,在A280監測收集第一洗脫峰;其中,所述HIV抗原和所述鑭系元素1標記試劑的質量比為1:1~10:1。
4.如權利要求1所述的分析法,其特征在于,所述步驟④中,具體制備步驟如下:將鏈霉親和素加入到截留分子量為10000的超濾離心管中,8000r/min離心5~6min,用pH8.0~9.8、50mmol/L碳酸鹽標記緩沖液重復洗滌后,將處理得到的鏈霉親和素加入到預先用標記緩沖液溶解的鑭系元素2標記試劑中,混勻,2~8℃振蕩孵育72±2h,反應液經用pH7.8、50mmol/L?Tris-HCl緩沖液平衡的層析柱層析,在A280監測收集第一洗脫峰;其中,所述鏈霉親和素和所述鑭系元素2標記試劑的質量比為1:1~10:1。
5.如權利要求1所述的分析法,其特征在于,所述步驟⑤中含有HIV標準抗體和HIV-1p24標準抗原的校準品采用以下方式制備:
用含有10g/L?BSA的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl緩沖液將HIV標準抗體原料和HIV-1p24標準抗原原料稀釋成含有0、0.5、1、2、4、8NCU/ml的HIV標準抗體和對應的0、10、40、160、640、1280U/ml的HIV-1p24標準抗原的混合校準品;或者,
用50%~55%的血細胞比容的全血將HIV標準抗體原料和HIV-1p24標準抗原原料制備成含有0、0.5、1、2、4、8NCU/ml的HIV標準抗體和對應的0、10、40、160、640、1280U/ml的HIV-1p24標準抗原的混合校準品,用采血濾紙作為載體,將制備好的含有HIV標準抗體和HIV-1p24標準抗原的混合校準品滴加到所述采血濾紙的6個不同位置上,室溫自然干燥后得到的干濾紙片校準品。
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