本申請是國際申請號為PCT/US2009/055657，國際申請日為2009年9月2日，進入中國國家階段的申請號為200980134871.X，名稱為“抗水解的聚丙烯酰胺凝膠”的發明專利申請的分案申請。

相關申請的交叉引用

本申請要求2008年9月2日提交的美國臨時專利申請號61/093,622之權利，且將其納入本文作參考。

技術領域

本發明屬于聚丙烯酰胺凝膠電泳領域，具體涉及抗水解的聚丙烯酰胺凝膠。

背景技術

聚丙烯酰胺凝膠電泳(“PAGE”)在研究、診斷和生化實驗室的廣泛應用主要是因為聚丙烯酰胺凝膠的光透明性和電中性，以及聚丙烯酰胺凝膠對于其中分離的多種大范圍分子量的物質的靈活性和適應性。這種靈活性來源于廠商通過改變丙烯酰胺單體的濃度，以及交聯劑通常是雙丙烯酰胺相對于單體的比例能夠控制凝膠的孔隙度。當十二烷基硫酸鈉(SDS)與合適的緩沖液摻入凝膠時，PAGE對于蛋白質分離尤其有用。常用的緩沖液是三(羥甲基)氨基甲烷(“Tris”)和雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷(“雙Tris”)。最初由Laemmli,U.K.,Nature227:680(1970)描述了一種著名的用于蛋白分離的聚丙烯酰胺凝膠，其中包含pH8.8的Tris-HCl作為緩沖液。然而，高pH導致這些凝膠即便冷藏也會隨時間水解。水解減少了每種蛋白質的遷移距離，降低了蛋白質條帶的分辨率。如果降低pH避免水解，凝膠分離蛋白質的清晰度降低，無法獲得對于蛋白質混合物的有用分析。

發明內容

現已發現使用三乙醇胺替代Tris和雙Tris，可使聚丙烯酰胺凝膠抗水解，即便是經過長期存儲，仍能夠在電泳條件下分離和解析蛋白質。因此，在本發明的某些實施方式中，相對于現有技術凝膠Tris、雙Tris或兩者的水平得以相當程度的降低，而另一些則完全沒有Tris和雙Tris。如下文所述，其它類型的試劑，如兩性電解質、共軛兩性電解質、穩定劑、pH值調節劑、條帶銳化劑以及其它緩沖劑可作為本發明的某些實施方式中的可選成分。在制備當日使用凝膠，或者長期儲存凝膠的過程中，通常使用三乙醇胺可提高條帶的分辨率。包含三乙醇胺還可以允許凝膠在高電壓下電泳而不降低條帶分辨率，這是現有技術凝膠則相反。使用三乙醇胺的另一優勢是在凝膠溶液緩沖至中性時仍能有效工作。另一優勢是本發明中含有三乙醇胺的凝膠可在廣泛的電泳緩沖液，包括含有不同于凝膠中陽離子的電泳緩沖液中使用，而不引起分辨率的顯著下降。因此可以在Tris-甘氨酸電泳緩沖液中使用該凝膠。

本說明書中所用“長期儲存中抗水解”的表述意思是在常用預制電泳凝膠存儲條件下，儲存超過1天，優選超過3天，更優選7天或更久，更優選1個月或更久，更優選6個月或更久的時間后，凝膠仍具有分析有用的蛋白質電泳分離的能力。本發明可用于任何尺寸和形狀的凝膠，包括管狀膠和平板凝膠，以及濃縮膠和分離膠的組合。本發明還可用于微流體裝置中的凝膠。

附圖說明

圖1是比較本發明范圍內含有不同水平天冬酰胺的兩塊凝膠與含有10摩爾%Tris-HCl的凝膠的電泳性能的拉姆力(Laemmli)圖。

圖2是比較本發明范圍內含有不同弱酸緩沖劑的四塊凝膠與含有10摩爾%Tris-HCl的凝膠的電泳性能的拉姆力圖。

具體實施方式

根據本領域熟知方法，在聚合催化劑的存在下，聚丙烯酰胺凝膠通過丙烯酰胺單體聚合并且以雙丙烯酰胺作為交聯劑形成，本發明可應用于大范圍孔隙度的聚丙烯酰胺凝膠。本領域還已知，孔隙度還可通過改變丙烯酰胺總濃度以及雙丙烯酰胺和總丙烯酰胺的比例進行控制。根據本領域的一般用途，總丙烯酰胺(即總的單體，包括交聯劑)濃度以重量百分比表示，記做符號T，而交聯劑與總單體的比例同樣以重量百分比表示，記做符號C。T或C值對于本發明不重要，但是在多數應用中，T的范圍約4%-25%，優選約8%-15%，C的范圍約2%-10%，優選約2.5%-5%。本領域已知促進聚合的催化劑的例子包括過硫酸銨、N,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、核黃素以及β-二甲基氨基丙腈，均以本領域熟練技術人員所知催化量使用。