技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種豬源產腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白及其應用，通過構建豬源腸毒素大腸桿菌的3個拷貝的鞭毛基因fliC重組質粒pRSET-3FliCon，將其轉入大腸桿菌表達融合蛋白。利用該融合蛋白制備的雞卵黃抗體能抑制ETEC在體外對上皮細胞的粘附，且抑制不同血清型的ETEC菌株。

背景技術

ETEC是引起新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的最主要病原菌之一(Nagy et al.,1990；Harel et al.,1991)。其引起的腹瀉死亡率上升，使得生產效率降低和治療成本增高，給畜牧業造成了巨大的經濟損失(Gaastra and Svennerholm,1996)。ETEC引起腹瀉的毒力因子主要包括：粘附素和腸毒素(Turner et al.,2006)，其能夠形成多種毒力因子以適應宿主(Smith and Halls,1967)。ETEC通過粘附素介導粘附腸粘膜上皮細胞，以便細菌定殖并大量繁殖，隨后分泌大量的腸毒素，造成腸粘膜上皮細胞的病理變化，引起腹瀉(Qadri et al.,2005)。

在世界養豬業中ETEC是引起仔豬腹瀉的主要的病原菌之一(Broes et al.,1988)。由于腸道大腸桿菌引起的一些疾病對養豬業造成了很大影響，引起人們對仔豬管理方面的重視。現在仔豬腹瀉較明顯的主要導致出生1-7天新生仔豬腹瀉和斷奶后一周的斷奶仔豬腹瀉(Amezcue et al.,2002；Verdonck et al.,2002)。ETEC引起的新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉對養豬業造成了巨大損失，主要體現為仔豬腹瀉，導致生長停滯，提高死亡率等(Verdonck et al.,2002)。據Gyles報道，在養豬業中，ETEC引起的腹瀉是最普遍的腸道疾病，全球每年100,000頭腹瀉仔豬中死亡率高達50％(Gyles,1994)。

鞭毛主要是螺旋菌、弧菌及多數桿菌和少數球菌的細胞膜表面一種絲狀結構蛋白，不僅是細菌的運動器官，而且鞭毛與細菌毒力有關，它在細菌的趨化作用和運動性中起重要作用(Bardy et al.,2003)。現有研究發現細菌的鞭毛能參與粘附粘膜和上皮細胞，如：綠膿桿菌(Arora et al.,1996)、霍亂弧菌(Richardson et al.,1991)、幽門螺桿菌(Eaton et al.,1996)、類鼻疽伯克霍爾德菌(Brett et al.,1994)。Chua等采用同源重組技術對假單胞桿菌強毒株KHW的fliC基因缺失突變，研究發現該突變菌株無鞭毛，并且在半固體瓊脂培養基上無運動性。實驗證明，與野生型假單胞桿菌相比，其繁殖能力并沒降低，但喪失了毒力功能。在感染老鼠后，從小鼠肺和脾中幾乎分離不到該細菌。Jorge等(2002)用腸致病性大腸桿菌(EPEC)感染3h的HeLa細胞，通過利用免疫熒光標記對鞭毛進行標記，發現EPEC的鞭毛能夠直接參與該細菌粘附宿主細胞，但發現其運動功能對其粘附宿主細胞作用不大。

Koushik Roy等(2009a)發現人源的產腸毒素大腸桿菌(H10407)分泌的雙伴侶分泌蛋白EtpA(雙伴侶胞外分泌蛋白)能夠介導鞭毛與腸上皮細胞(HCT-8和Caco-2細胞系)粘附過程。通過試驗作者發現抗EtpA抗體和抗鞭毛蛋白抗體能夠抑制多種H血清型的ETEC粘附宿主細胞。為預防ETEC性腹瀉提供兩種具有一定廣譜性的免疫抗原。在參與粘附過程中，Koushik Roy等通過構建完整(1-498aa)和不完整的FliC蛋白(1-173aa和174-498aa區域)進行免疫共沉淀捕獲EtpA蛋白，發現完整的FliC蛋白和不完整的FliC蛋白(1-173aa區域)都能與EtpA蛋白作用，而不完整的FliC蛋白(174-498aa區域)不能與EtpA蛋白作用，同時以完整的FliC蛋白和不完整的FliC蛋白(1-173aa區域)兩個蛋白作為免疫原都能起到抑制細菌粘附宿主細胞的效果，也進一步確定了參與粘附作用的主要是鞭毛蛋白FliC的保守區域(1-173aa區域)。現有研究報道，豬源ETEC(F18ab)鞭毛蛋白作為一種重要的毒力因子參與感染豬源細胞系IPEC-J2(Duan et al.,2012)。從而推測豬源ETEC鞭毛蛋白可以作為一種候選蛋白作為預防仔豬腹瀉的疫苗研制。

大量研究結果表明，通過給幼齡動物提供外源抗體(包括血清抗體和卵黃抗體)能夠有效的提高被動免疫水平，對于預防和治療細菌和病毒感染(特別是腸道腹瀉)是一種較為有效的途徑(Hatta et al.,1993；王劼,2007)。