技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及評價具有凝血因子VIII(FVIII)功能代替活性的物質(zhì)介導(dǎo)的凝血反應(yīng)的方法。另外，本發(fā)明涉及包含活化凝血因子XI(FXIa)的用于評價凝血反應(yīng)的試劑、以及包含該試劑的用于評價具有凝血因子VIII(FVIII)功能代替活性的物質(zhì)介導(dǎo)的凝血反應(yīng)的試劑盒等。

背景技術(shù)

血友病是凝血因子VIII（FVIII）或凝血因子IX（FIX）先天缺乏或功能不全引起的出血性疾病。前者稱為血友病A，后者稱為血友病B。它們的基因都存在于X染色體上，基因異常通過性連鎖隱性遺傳傳遞，因此發(fā)病患者中99%以上是男性。已知患病率是出生男子1萬人中大約1人，血友病A與血友病B的比率大約是5:1。

血友病患者中主要的出血部位可列舉關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、口腔內(nèi)、顱內(nèi)、消化道、鼻腔內(nèi)等。其中關(guān)節(jié)內(nèi)反復(fù)出血進(jìn)展為關(guān)節(jié)障礙、伴有步行困難的血友病性關(guān)節(jié)病，有時最終需要關(guān)節(jié)置換術(shù)。因此，是降低血友病患者的QOL的主要原因。

血友病的嚴(yán)重程度與血液中FVIII活性或FIX活性密切相關(guān)。活性不足1%的患者歸類為重度、活性為1%以上不足5%的患者歸類為中度、活性為5%以上不足40%的患者歸類為輕度。占血友病患者約半數(shù)的重度患者中，每月出現(xiàn)幾次出血癥狀，這是與中度患者以及輕度患者相比顯著高的頻率。因此認(rèn)為，重度血友病患者中，通過FVIII或FIX補充療法將血液中FVIII活性或FIX活性維持在1%以上，對于阻止出血癥狀出現(xiàn)是有效的（非專利文獻(xiàn)1）。

作為相關(guān)的出血異常，除血友病、后天性血友病之外，還已知馮維勒布蘭德因子（von Willebrand factor，vWF）功能異常或缺乏引起的馮維勒布蘭德病。vWF不僅對于血小板與血管壁的損傷部位的內(nèi)皮下組織正常粘附是必須的，對血小板與FVIII形成復(fù)合物保持血液中FVIII水平正常也是必須的。馮維勒布蘭德病患者中，這些功能降低，引起止血功能異常。

為了預(yù)防和/或治療血友病患者中的出血，主要應(yīng)用從血漿純化或通過基因重組技術(shù)制備的凝血因子。

作為監(jiān)測FVIII等凝血因子的藥效的方法，已知活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、基于APTT的一段式凝血法（APTT-based one-stage coagulation method）、凝血酶生成試驗(TGA)等。APTT和一段式凝血法長期廣泛地用作監(jiān)測FVIII制劑藥效的方法。APTT為下列方法，在被測血漿中加入APTT試劑后，加入CaCl₂，測定纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白的時間，即至凝固起始的時間。一段式凝血法為下列方法，將用緩沖液以固定比例稀釋的被測血漿加入FVIII缺乏血漿中，以與APTT相同的方法測定凝固時間，由應(yīng)用連續(xù)稀釋的正常血漿代替被測血漿得到校準(zhǔn)曲線求出被測血漿的FVIII活性。TGA為下列試驗，應(yīng)用針對凝血酶的熒光底物，以酶活性隨時間測定凝血反應(yīng)亢進(jìn)中生成的凝血酶量(非專利文獻(xiàn)2)。TGA中，能夠評價從凝血反應(yīng)的凝血酶生成起始階段至凝血反應(yīng)擴(kuò)增時的凝血酶生成的一系列凝血反應(yīng)。進(jìn)一步，對用于TGA的凝固起始試劑，報告了以低濃度的磷脂溶液（4μM）為基礎(chǔ)組合低濃度的組織因子的試劑(非專利文獻(xiàn)2)、組合FIXa的試劑(非專利文獻(xiàn)3、4)、組合FXII活化劑（鞣花酸）的試劑(非專利文獻(xiàn)5)、組合低濃度的組織因子及FXII活化劑（鞣花酸）的混合溶液的試劑(非專利文獻(xiàn)5)。

近年來，發(fā)現(xiàn)了與活化凝血因子IX（FIXa）以及第X因子（FX）二者結(jié)合、具有代替FVIII的輔因子功能、即促進(jìn)FIXa介導(dǎo)的FX活化的功能的功能的雙特異性抗體(專利文獻(xiàn)1-3)。但是，該雙特異性抗體雖然代替FVIII的功能，其作用表現(xiàn)機(jī)制與FVIII的該機(jī)制不完全相同。例如，F(xiàn)VIII僅在由FXa、凝血酶活化后開始顯示輔因子活性，但上述雙特異性抗體無需該活化過程顯示輔因子活性。因此，現(xiàn)有FVIII的藥效監(jiān)測方法不一定能夠適用。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1 : Astermark J. Haemophilia. 2003 9(Suppl.1) 32

非專利文獻(xiàn)2 : Pathophysiol Haemost Thromb. 2003;33(1):4

非專利文獻(xiàn)3 : J Thromb Haemost. 2011 Aug;9(8):1549-55