技術領域

本發明涉及一種蘆筍種間雜交后代花藥培養誘導獲得再生植株的培養方法。?

背景技術

蘆筍（Asparagus?officinalis?L.），又名石刁柏，屬百合科天門冬屬宿根性多年生草本植物，是一種深受消費者喜愛的營養保健型高檔蔬菜，享有“蔬菜之王”的美譽。目前，我國蘆筍產業發展迅速，種植和銷售量均躍居世界首位。因許多產區濕熱氣候和引進品種的生態適應性問題，蘆筍莖枯病在我國發病最為嚴重，全國各蘆筍產區都有發生，且南方重于北方，常導致成片絕收，已成為制約中國蘆筍產業發展的主要瓶頸之一。當前，國內外所有蘆筍栽培品種均無一例外感染莖枯病，廣泛搜集與篩選抗源后，發現蘆筍近緣野生種興安天門冬高抗莖枯病，利用其與蘆筍栽培品種進行種間雜交，產生的F₁對莖枯病具有抗性，其回交后代和F₂群體對莖枯病的抗性則有分離，因此，開展蘆筍生物技術育種工作對我國蘆筍育種體系進一步完善意義重大，而蘆筍種間雜交后代花藥誘導培養獲得再生植株是一項加速蘆筍種間雜交后代穩定純化的有效方法，能明顯縮短蘆筍抗病育種的進程，具備巨大的市場應用前景。?

發明內容

本發明的目的在于提供了一種蘆筍栽培種與興安天門冬種間雜交F₁代花藥誘導培養獲得再生植株的方法，它具有提高育種效率和操作簡單方便的優點。?

本發明是這樣來實現的，一種蘆筍栽培種與興安天門冬種間雜交F₁代花藥誘導培養獲得再生植株的方法，所述方法包括以下步驟：（1）取蘆筍種間雜交后代的花蕾作為花藥培養的供體，于黑暗條件下4℃處理1-7d，待用；（2）將滅菌后的蘆筍種間雜交后代花蕾小心剝開，取花藥接入裝有添加激素和蔗糖的MS液體培養基的培養皿中，將培養皿在黑暗條件下于30℃～32℃恒溫熱激處理2～3d后，在黑暗條件下于23℃～28℃培養20～30d，至肉眼可見時，在黑暗條件下于23℃～28℃再振蕩培養20～25d，得到需要的胚狀體；（3）將所述胚狀體接種到含有細胞分裂素的再生培養基中，在每天10～16?h光照和23℃～28℃下培養，形成再生芽；（4）切取叢生芽接種至生根培養基中，將生長健壯的有根苗煉苗后移栽至基質中，得到再生植株。（5）取再生植株的莖尖或根尖進行倍性鑒定。?

上述培養基配方分別為：幾種培養基所用的基本培養基均為MS，所用的碳源為蔗糖；配制液體培養基即在MS中，添加0.5～0.8?mg﹒L^-1的6-芐胺基腺嘌呤6-BA，0.5～1.0?mg﹒L^-1的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，0.1～0.2?mg﹒L^-1萘乙酸NAA，6%～7%的蔗糖，pH5.8；固體培養基添加的凝固劑為瓊脂，其濃度為0.7%～0.8%，再生培養基即在MS培養基中，添加0.2～0.3?mg﹒L^-1的6-芐胺基腺嘌呤6-BA，?3%～4%的蔗糖，pH5.8；生根培養基即在MS培養基中，添加0.05～0.1?mg﹒L^-1的萘乙酸NAA，3%～4%的蔗糖，pH5.8。?

本發明的技術效果是：（1）選具有優良性狀的蘆筍種間雜交后代，取其花蕾作為試材，通過花蕾前處理、無菌狀態剝取花藥、接種花藥、培養花藥、誘導胚狀體再生形成再生植株等關鍵技術點，高效快速地獲得蘆筍種間雜交后代小孢子來源的再生植株；（2）本發明首次獲得蘆筍種間雜交后代花培胚狀體，并誘導生根形成再生植株，從開始培養到獲得胚狀體一般僅用6～8周時間，顯著提高選擇效率，節省大量人力、物力，為加速蘆筍種間雜交后代穩定、純化及高效選育蘆筍抗病品種等提供了新途徑。?

具體實施方式

通過以下實例，對本發明作進一步的詳細說明；?

實例一

（1）取蘆筍種間雜交后代的花蕾作為花藥培養的供體，于黑暗條件下4℃處理1～3d，待用；

（2）將滅菌后的蘆筍種間雜交后代花蕾小心剝開，取花藥接入裝有添加激素和蔗糖的MS液體培養基的培養皿中，將培養皿在黑暗條件下于30℃～31℃恒溫熱激處理2d后，在黑暗條件下于23℃～28℃培養20～23d，至肉眼可見時，在黑暗條件下于23℃～28℃再振蕩培養20～22d，得到需要的胚狀體，誘導率達到23.5%；

（3）將所述胚狀體接種到含有細胞分裂素的再生培養基中，在每天10～16?h光照和23℃～28℃下培養，形成再生芽；

（4）切取叢生芽接種至生根培養基中，將生長健壯的有根苗煉苗后移栽至基質中，得到再生植株。